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Pequeños inhibidores de la molécula de SARS-CoV-2 determinado revisando

Incluso durante el desarrollo vaccíneo continúa contra el coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática, intentando traer un extremo al pandémico de la enfermedad 2019 del coronavirus (COVID-19), las nuevas variantes emergen que las capacidades inmunes del escape de la demostración. Las drogas de manera efectiva y seguras siguen siendo así esenciales tratar infecciones severas con este virus.

Una nueva prueba preliminar, liberada en el servidor del bioRxiv*, describe la identificación de los pequeños inhibidores de la molécula que ciegan la actividad catalítica de la proteína no-estructural viral crucial 5 (nsp5), usando un método de cribado en grande.

La importancia de nsp5

Por lo menos nueve enzimas del virus son importantes para la proliferación viral y son así ideales para el revelado de drogas antivirus. Estas enzimas tienen la misma serie entre diversos coronaviruses, a diferencia del pico, del nucleocapsid y de otras proteínas estructurales que se conserven menos. Esto hace las vacunas basadas en la última evasión inmune más propensa de las proteínas por mutaciones virales del escape.

El anterior, por otra parte, podría permitir el revelado de uno o más tratamientos comunes del coronavirus (CoV), que es tan importante que el pandémico SARS-CoV-2 es el coronavirus altamente patógeno del tercero para pegar el mundo.

La proteasa principal nsp5 de SARS-CoV-2 es una enzima relacionada con la quimotripsina, e hiende los polyproteins grandes sintetizados por los dos marcos de lectura abiertos que recubren (ORF 1a y ORF 1ab), en 11 diversos sitios. El resultado de la actividad nsp5 es la producción de nsp4 a nsp16.

Estas enzimas se requieren fijar el complejo viral de la transcripción de la réplica, donde la réplica viral ocurre después de asiento viral en la célula. La estructura y la función de nsp5 se conserva altamente, con el uso común del 96% de la serie entre los SARS-CoV y el virus actualmente de circulación.

Esta proteína viral tiene un sitio de la hendidura que ocurra después de un residuo de la glutamina, como con la mayoría de las otras proteasas de la cañería maestra de CoV. Esta característica es infrecuente en proteasas humanas, e indica que una droga de la cubeta-coronavirus puede ser posible. El primer paso es descrito en este estudio, por el uso de una pantalla de la droga de la alto-producción.

¿Cuáles son los resultados?

Los investigadores utilizaron un nsp5 integral expresado en un sistema bacteriano, a saber, Escherichia Coli. Una prueba de su eficiencia en un sitio de la hendidura mostró su alta afinidad, como se esperaba.

Fijan una transferencia de energía modificada para requisitos particulares de resonancia de Forster, un análisis Traste-basado, donde los aminoácidos de un péptido 10 se utilizan de largo para probar la actividad enzimática usando señales fluorescentes. La reacción sigue un camino áspero lineal en una concentración de 10 nanómetro, para los primeros 20 minutos de reacción en la temperatura ambiente.

El substrato para la enzima estaba presente en tal concentración en cuanto a asegura la identificación de inhibidores competitivos y no competitivos, y del glicerol, así como el detersorio, fue agregado para estabilizar la enzima.

Una biblioteca de la droga fue utilizada para la alta pantalla de la producción (HTS), conteniendo sobre 5.000 composiciones, usadas en las concentraciones de 4 μM y de 0,8 μM. Todas las composiciones que redujeron la actividad nps5 por el 30% en la concentración de 4 μM fueron tomadas para ser golpes primarios.

Las composiciones fueron incubadas con la enzima antes de que la reacción comenzara de modo que los inhibidores que atan despacio a la enzima no fueran excluidos.

También determinaron golpes artificiales, siendo las que produjeron un índice de positivo falso de reacción interfiriendo con la señal fluorescente del HTS. las composiciones Auto-fluorescentes fueron excluidas.

El estudio determinó cuatro inhibidores específicos nsp5 durante la fase in vitro. También encontraron que una droga llamada ebelsen, descrito como inhibidor nsp5 pero no determinado como golpe en esta pantalla, sólo está inhibido la enzima bajo condiciones no reductores.

resultados Célula-basados del análisis

Los golpes superiores entonces fueron probados en un análisis célula-basado para que su capacidad inhiba la réplica viral. Encontraron que la inhibición más potente ocurrió con el inhibidor 1 de Calpain, con una concentración el 50% efectiva (EC50) de 0,28 μM. En cambio, otros pegados, el inhibidor de Z-VAD-FMK, mostrado actividad solamente en los niveles sobre el μM 100.

Cuando las combinaciones de inhibidores fueron probadas, encontraron que ningunos de estos inhibidores aumentaron la eficacia del remdesivir, un inhibidor ARN-relacionado de la polimerasa de ARN de uso general en tratar la infección SARS-CoV-2.

Inhibidores peptidomimetic de FMK

Los inhibidores peptidomimetic de FMK (grupo del fluoromethylketone) fueron encontrados para tener la potencia inhibitoria in vitro más grande. Todos tienen una pieza que aumente permeabilidad de la célula, una serie de alcance peptidil corta, y a un grupo funcional que experimente el atascamiento covalente a y desactive el residuo activo de la cisteína en proteasas.

Encontraron que en todos los inhibidores peptidomimetic, el grupo de FMK es el grupo funcional. Éstos no muestran ninguna signos de la toxicidad de la célula in vitro pero in vivo, se metabolizan al fluoroacetate, una composición tóxica.

Usando opciones más seguras, tales como inhibidores basados en el grupo funcional de la difluorophenoxymethyl-cetona (OPh), que son disponibles en el comercio, él encontró ese uno de éstos, a saber, Q-IETD-OPh, era el inhibidor más potente, con una concentración el 50% inhibitoria (IC50) del μM 17,4.

Aunque éstos no estaban en la biblioteca original, estos péptidos se asemejan de cerca a los golpes primarios superiores, difiriendo solamente por el grupo funcional. Con todo son inhibidores menos potentes de la enzima in vitro comparada a los inhibidores de FMK.

Puesto que se sabe que los residuos hidrofóbicos grandes desempeñan un papel en el reconocimiento de los substratos, cambiaron la serie del grupo funcional peptidil para aumentar el efecto inhibitorio sobre nsp5. Estos tres modificaron los inhibidores de FMK para requisitos particulares tenían 4-6 aminoácidos en este segmento, comparado a 3-4 en las moléculas originales.

El grupo peptidil aquí se asemejó a la serie natural en el sitio de la hendidura nsp4/5, pero con la substitución de un ácido aspártico y de una alanina para una glutamina y una treonina en los sitios P1 y P6.

El resultado era marcado los valores perfeccionados IC50, colocando a partir de la 0,02 a 0,8 nanómetros para el péptido más corto de los tres. La composición con el IC50 más inferior, Z-AVLD-FMK, es así mucho más inhibitoria que la mejor composición comercial disponible, Z-VAD-FMK, con un IC50 de 0,16 μM.

Relanzando la prueba in vivo, encontraron la concentración el 50% efectiva (EC50) para ser el μM 66, indicando el doble la potencia comparada al inhibidor comercial superior. “Esto mostró que eso el cambio de la mitad peptidil para imitar el substrato nsp5 grandemente perfeccionó su efecto inhibitorio in vitro y célula-basado.

Implicaciones y direcciones futuras

El inhibidor 1 de Calpain se ha mostrado para ser seguro en ratones, con la inhibición del incremento viral en un análisis célula-basado. Es por lo tanto un buen candidato al revelado antivirus en el pandémico actual.

En segundo lugar, los péptidos célula-permeables de FMK se pueden utilizar para inhibir las proteasas específicas alterando sus series peptidiles para ser idénticos a la serie del substrato proteasa-obligatorio - en este caso, la serie preferida nsp5-binding.

“El más corto de los inhibidores de encargo, Z-AVLD-FMK, mostró potencia extraordinaria del inhibidor in vitro con un IC50 sub-nanomolar.” La potencia era todavía más alta en el análisis célula-basado, mostrando que los inhibidores peptidomimetic se pueden adaptar fácilmente para explorar la actividad de esta enzima, in vitro y en cultivo celular.

El revelado adicional podía incluir la incorporación de la glutamina común en los sitios de la hendidura, en los sitios P1, o usar el grupo de OPh después del arreglo para requisitos particulares conveniente de la serie del substrato, en vez de la mitad de FMK con sus metabilitos tóxicos.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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