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Ha potuto in vitro guida glycoengineering produrre i migliori candidati della punta SARS-CoV-2 per la ricerca vaccino?

Un problema dell'irritazione nello sviluppo dei vaccini è stato la necessità di raggiungere il giusto profilo della glicosilazione per gli antigeni virali. Un nuovo studio, recentemente rilasciato come pubblicazione preliminare sul " server " del bioRxiv*, mostra come un approccio senza cellula sequenziale ha prodotto N-glycans complesso dai tipi più semplici, in una reazione del un-vaso.

Ciò potrebbe essere usata ottenere a rapido e facilmente c'è ne di grande schiera di N-glycans sui candidati vaccino potenziali dell'antigene per effettuare le prove animali e la prova preclinica, tali che è possibile presentare il loro impatto sulla risposta immunitaria e migliorare l'efficacia dei vaccini dell'sottounità della proteina.

Studio: Glycoengineering senza cellula della glicoproteina recombinante della punta SARS-CoV-2. Credito di immagine: Design_Cells/Shutterstock

Glicosilazione della proteina

La glicosilazione delle proteine è critica nella determinazione delle molte caratteristiche biologiche di una proteina, compreso la sue struttura, funzione, la solubilità, trafficando all'interno di ed attraverso le membrane cellulari e l'associazione ai leganti. La distribuzione e l'escrezione del composto come pure la sua conversione ad altri metaboliti, dipendono egualmente in larga misura dall'aggiunta dei residui glicosilici.

Quando si tratta delle particelle virali, la glicosilazione pregiudica il collegamento virale alle cellule ospiti come pure la versione delle particelle dell'esca per sviare gli anticorpi e le celle immuni. La glicosilazione è egualmente chiave all'epitopo di immune-elusione che protegge, facendo uso della propria apparecchiatura della glicosilazione delle cellule.

Ciò è una transenna importante per sviluppo del vaccino. Inoltre, non appena la presenza di N-glycans ma del glycoform stesso pregiudica l'associazione del virus, del suo infectiousness, dell'antigenicità e dell'immunizzazione. La rassomiglianza raggiunta fra gli antigeni e le proteine immunodominant virali della cellula ospite dal loro profilo di superficie della glicosilazione è pensata per avvantaggiare il virus.

Dall'altro lato, i residui glicosilici specifici hanno potuto essere manipolati per migliorare l'efficacia vaccino, discutono i ricercatori. Ciò rimane un campo della ricerca aperta ed in corso.

Il profilo della glicosilazione della punta SARS-CoV-2

Il coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo è un virus con acido ribonucleico unico incagliato (RNA). Ha tre proteine immunogene della membrana, la punta o la proteina di S, una proteina integrale della membrana e una proteina di rivestimento, che comprendono la sua busta. La glicoproteina di S impegna il ricevitore dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2 della cellula ospite (ACE2) per compire l'entrata virale.

La proteina di S è molto glicosilata, con sopra un punteggio dei siti della N-glicosilazione, più di molti altri virus.

In vitro glycoengineering

Questi residui sono studiati spesso nelle linee cellulari quali le celle di HEK, in cui i profili unici della glicosilazione sono prodotti sulle proteine. Ciò richiede i protocolli specifici di essere usata con ogni linea cellulare distinta, rendente la lavoro-pesante.

Le glicoproteine variano tra di loro e perfino all'interno della stessa classe, rendentegli un'ulteriore sfida per capire quanto modellano esattamente la risposta immunitaria nei modelli animali.

Come alternativa efficiente, le tecniche per la produzione sia dei glycosyltransferases eucariotici che batterici all'interno delle impostazioni senza cellula del un-vaso smerigliatrice con attenzione per permettere il trattamento glycan. Ciò può essere usata per costruire i glycoforms sulle proteine, indipendentemente dal sistema delle cellule usato per l'espressione della proteina.

In vivo il N-glycan oligomannose tipo Man5 è convertito in glycans complesso tipi dai mannosidases e MGAT1, MGAT2 e GalT. I substrati per queste reazioni sono UDP-GlcNAc e UDP-galattosio, rispettivamente. B) Questo trattamento può essere ricostruito in vitro per sintetizzare le strutture complesso tipe sulle proteine recombinanti cella-derivate insetto con N-glycans paucimannose tipo, come Man3.
A) In vivo il N-glycan oligomannose tipo Man5 è convertito in glycans complesso tipi dai mannosidases e MGAT1, MGAT2 e GalT. I substrati per queste reazioni sono UDP-GlcNAc e UDP-galattosio, rispettivamente. B) Questo trattamento può essere ricostruito in vitro per sintetizzare le strutture complesso tipe sulle proteine recombinanti cella-derivate insetto con N-glycans paucimannose tipo, come Man3.

Che cosa sono i risultati?

Nello studio corrente, una reazione sequenziale senza cellula del un-vaso è stata utilizzata a con successo converte N-glycans paucimannose tipo fucosylated e afucosylated in N-glycans galactosylated complesso tipo.

Lo studio corrente ha combinato i glycosyltransferases umani recombinanti in una reazione senza cellula del un-vaso, poiché sono conosciuti per essere espressi in Escherichia coli e efficacemente a glycosylate le proteine recombinanti in questa regolazione.

Lo studio ha usato tre glycosyltransferases co-espressi in Escherichia coli per convertire il semplice tipico, il basso mannosio, N-glycans della punta recombinante SARS-CoV-2 delle nelle strutture ricche galactosyl complesse mammifere classiche.

I risultati indicano che mannose-3-glycans, con e senza il fucosylation, in gran parte sono stati convertiti in residui galactosylated corrispondenti.

Otto di 22 siti della N-glicosilazione erano ricchi di N-glycans oligomannose tipo, probabilmente più a causa dell'ostacolo sterico agli enzimi glycan di trattamento nei reparti di lavorazione, piuttosto che a causa della linea cellulare usata.

La proteina costruita della punta in questa regolazione ha avuta N-glycans galactosylated complesso abbondante, con un certi ibrido e N-glycans oligomannose tipo pure. Tuttavia, N-glycans complesso tipo sull'essere umano cella-ha derivato le proteine della punta egualmente mostra i residui acidi sialici e le strutture multi-antennary.

Applicazioni in vitro di glycoengineering

Il sistema che di espressione delle cellule dell'insetto hanno usato con l'inoculazione del baculovirus è capace di trattamento efficiente della proteina eucariotica, è facilmente evolutivo e risulta un gran numero di proteina costruita, rendentegli l'ideale per la lavorazione vaccino dell'sottounità della proteina.

Il glycoform prodotto in tali sistemi è abbastanza distinto da quello prodotto in cellule di mammiferi, in celle di quell'insetto esprima principalmente il basso mannosio N-glycans ibrido, ma il N-glycans oligomannose tipo posteriore e complesso. Tuttavia, le varianti pure della punta prodotte nello studio corrente hanno mostrato il reticolo posteriore, che è molto insolito per questo sistema di espressione.

Tre vaccini prodotti da questa via già sono stati conceduti una licenza a, vale a dire, Flublok®, Cervarix® e Provenge®, contro influenza, il papillomavirus umano ed il carcinoma della prostata. Molto, compreso alcuno contro COVID-19, stanno sviluppandi.

Un ectodomain recombinante della punta prodotto da un sistema di espressione delle cellule dell'insetto già è stato indicato per essere molto immunogeno negli studi del primate non umano. Facendo uso di questa tecnologia, un vaccino dell'sottounità della proteina (RBD-Dimero) contro COVID-19 corrente è approvato in Cina. I vaccini di Glaxo-Smith-Kline e di Novavax stanno attendendo l'approvazione.

L'uso dei glycans non umani che comprendono l'acido o il α di N-glycolylneuraminic, residui del galattosio 1-3-linked potrebbe aumentare il risparmio di temi delle risposte immunitarie, ma più lavoro è richiesto di eliminare la loro allergenicità.

Catturata insieme, una sovrapposizione significativa del glycoform è stata generata. Se la sovrapposizione è egualmente sito-specifica resta studiare in futuro.„

Che cosa sono le implicazioni?

L'approccio glycoengineering in vitro per produrre N-glycans complesso tipo modificando le linee cellulari dell'insetto offre l'indipendenza della linea cellulare del produttore e la versatilità aumentata per permettere molti glycoforms differenti se sono strutturalmente simili.  

La disponibilità dei nucleotidi dello zucchero, che sono i substrati per questo trattamento, alle tariffe commerciali sarà chiave a upscaling questa tecnologia.

L'uso delle linee cellulari transitorie dell'insetto, è un tale approccio glycoengineering in vitro, ma la sua stabilità nella produzione su grande scala non è stata confermata. D'altra parte, l'espressione simultanea dei glycosyltransferases per produrre N-glycans complesso tipo, come usato dai ricercatori correnti, colloca più domande sul metabolismo delle cellule e diminuisce la crescita delle cellule.

Mentre molto più lavoro resta fare, glycoengineering in vitro può essere utile grande produrre gli antigeni vaccino potenziali e capire come la glicosilazione pregiudica la risposta immunitaria. In generale, queste strategie hanno potuto essere usate per produrre i glycoforms altamente su misura per i candidati vaccino virali principali, compreso le piattaforme come i virus attivati ed attenuati, o le particelle del tipo di virus.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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