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Podia in vitro ajuda glycoengineering produzir melhores candidatos do ponto SARS-CoV-2 para a pesquisa vacinal?

Um problema aborrecendo na revelação das vacinas foi a necessidade de conseguir o perfil direito do glycosylation para os antígenos virais. Um estudo novo, liberado recentemente como uma pré-impressão no server do bioRxiv*, mostra como uma aproximação sem célula seqüencial produziu N-glycans complexo de uns tipos mais simples, em uma reacção do um-potenciômetro.

Isto poderia ser usado para obter a ràpida e facilmente alguma de uma grande disposição de N-glycans em candidatos vacinais potenciais do antígeno a fim realizar as experimentações animais e o teste pré-clínico, tais que é possível apresentar seu impacto na resposta imune e aumentar a eficácia de vacinas da subunidade da proteína.

Estudo: Glycoengineering sem célula da glicoproteína de recombinação do ponto SARS-CoV-2. Crédito de imagem: Design_Cells/Shutterstock

Glycosylation da proteína

O Glycosylation das proteínas é crítico em determinar muitas características biológicas de uma proteína, incluindo suas estrutura, função, solubilidade, traficando dentro e através das membranas e do emperramento de pilha às ligantes. A distribuição e a excreção do composto, assim como sua conversão a outros metabolitos, são igualmente dependentes em grande parte da adição de resíduos glycosyl.

Quando se trata das partículas virais, o glycosylation afecta o acessório viral às pilhas de anfitrião assim como a liberação de partículas do chamariz para desviar do assunto anticorpos e pilhas imunes. O Glycosylation é igualmente chave ao resumo da imune-ilusão que protege, usando instrumento do glycosylation da pilha próprio.

Este é um obstáculo principal para a revelação vacinal. Além disso, não apenas a presença de N-glycans mas do glycoform próprio afecta o emperramento do vírus, de seu infectiousness, de antigenitura e de imunogenicidade. A semelhança conseguida entre antígenos immunodominant virais e proteínas da pilha de anfitrião por seu perfil de superfície do glycosylation é pensada para beneficiar o vírus.

No outro lado, os resíduos glycosyl específicos podiam ser manipulados para melhorar a eficácia vacinal, argumentem os pesquisadores. Esta permanece uma área da pesquisa aberta e em curso.

O perfil do glycosylation do ponto SARS-CoV-2

O coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) é um vírus com ácido ribonucléico único-encalhado (RNA). Tem três proteínas imunogenéticas da membrana, o ponto ou a proteína de S, uma proteína integral da membrana e uma proteína de envelope, que compreendem seu envelope. A glicoproteína de S contrata o receptor deconversão da enzima 2 da pilha de anfitrião (ACE2) para realizar a entrada viral.

A proteína de S é pesadamente glycosylated, com sobre uma contagem de locais do N-glycosylation, mais do que muitos outros vírus.

In vitro glycoengineering

Estes resíduos são estudados frequentemente nas linha celular tais como as pilhas de HEK, onde os perfis originais do glycosylation são produzidos nas proteínas. Isto exige protocolos específicos ser usado com cada linha celular distinta, fazendo o trabalho-pesado.

As glicoproteína variam entre se e mesmo dentro da mesma classe, fazendo lhe um desafio adicional para compreender como exactamente dão forma à resposta imune nos modelos animais.

Como uma alternativa eficiente, as técnicas para a produção de glycosyltransferases eucarióticas e bacterianos dentro dos ajustes sem célula do um-potenciômetro foram afiadas com cuidado para permitir o processamento glycan. Isto pode ser usado para projectar glycoforms em proteínas, independentemente do sistema da pilha usado para a expressão da proteína.

O oligomannose-tipo N-glycan Man5 é convertido in vivo no complexo-tipo glycans por mannosidases e MGAT1, MGAT2 e GalT. As carcaças para estas reacções são UDP-GlcNAc e UDP-galactose, respectivamente. B) Este processo pode ser remodelado in vitro para sintetizar o complexo-tipo estruturas em proteínas de recombinação pilha-derivadas insecto com paucimannose-tipo N-glycans, como Man3.
A) O oligomannose-tipo N-glycan Man5 é convertido in vivo no complexo-tipo glycans por mannosidases e MGAT1, MGAT2 e GalT. As carcaças para estas reacções são UDP-GlcNAc e UDP-galactose, respectivamente. B) Este processo pode ser remodelado in vitro para sintetizar o complexo-tipo estruturas em proteínas de recombinação pilha-derivadas insecto com paucimannose-tipo N-glycans, como Man3.

Que são os resultados?

No estudo actual, uma reacção seqüencial sem célula do um-potenciômetro foi utilizada a com sucesso converte o paucimannose-tipo fucosylated e afucosylated N-glycans ao complexo-tipo N-glycans galactosylated.

O estudo actual combinou glycosyltransferases humanos de recombinação em uma reacção sem célula do um-potenciômetro, desde que são sabidos para ser expressados eficazmente em Escherichia Coli e ao glycosylate as proteínas de recombinação neste ajuste.

O estudo usou três glycosyltransferases co-expressados em Escherichia Coli para converter a simples típico, baixo-manose, N-glycans do ponto SARS-CoV-2 de recombinação nas estruturas galactosyl-ricas complexas mamíferas clássicas.

Os resultados indicam que mannose-3-glycans, ambos com e sem o fucosylation, estiveram convertidos pela maior parte aos resíduos galactosylated correspondentes.

Oito de 22 locais do N-glycosylation eram ricos no oligomannose-tipo N-glycans, provavelmente mais devido ao obstáculo steric às enzimas de processamento glycan nas áreas de processamento, um pouco do que devido à linha celular usada.

A proteína projetada do ponto neste ajuste teve complexo abundante N-glycans galactosylated, com alguns híbrido e oligomannose-tipo N-glycans também. Contudo, o complexo-tipo N-glycans no ser humano pilha-derivou proteínas do ponto igualmente mostra resíduos ácidos sialic e estruturas multi-antennary.

Aplicações in vitro de glycoengineering

O sistema que da expressão da pilha do insecto se usaram com inoculação do baculovirus é capaz do processamento eficiente da proteína eucariótica, é facilmente evolutivo e despeja as grandes quantidades de proteína projetada, fazendo lhe o ideal para a fabricação vacinal da subunidade da proteína.

O glycoform produzido em tais sistemas é bastante distinto daquele produzido em pilhas mamíferas, em pilhas desse insecto expresse na maior parte a baixo-manose N-glycans híbrido, mas o último, oligomannose-tipo complexo N-glycans. Contudo, as variações puras do ponto produzidas no estudo actual mostraram o último teste padrão, que é muito incomum para este sistema da expressão.

Três vacinas produzidas por este caminho têm sido licenciadas já, a saber, Flublok®, Cervarix® e Provenge®, contra a gripe, o papillomavirus humano, e o cancro da próstata. Muito mais, incluindo algum contra COVID-19, estão sendo desenvolvidas.

Um ectodomain de recombinação do ponto produzido por um sistema da expressão da pilha do insecto tem sido mostrado já para ser muito imunogenético em estudos não-humanos do primata. Usando esta tecnologia, uma vacina da subunidade da proteína (RBD-Dímero) contra COVID-19 é aprovada actualmente em China. As vacinas de Novavax e de Glaxo-Smith-Kline estão esperando a aprovação.

O uso dos glycans não-humanos que incorporam o ácido ou o α de N-glycolylneuraminic, resíduos da galactose 1-3-linked poderia aumentar a eficiência de respostas imunes, mas mais trabalho é exigido ordenar para fora sua alergenicidade.

Tomada junto, uma sobreposição significativa do glycoform foi gerada. Se a sobreposição é igualmente local-específica permanece ser investigado no futuro.”

Que são as implicações?

In vitro a aproximação glycoengineering para produzir o complexo-tipo N-glycans alterando linha celular do insecto oferece a independência da linha celular do produtor, e a versatilidade aumentada permitir muitos glycoforms diferentes se são estrutural similares.  

A disponibilidade dos nucleotides do açúcar, que são as carcaças para este processo, em taxas comerciais será chave a upscaling esta tecnologia.

O uso de linha celular transientes do insecto, é uma tal in vitro aproximação glycoengineering, mas sua estabilidade na produção em grande escala não foi confirmada. Por outro lado, a expressão simultânea dos glycosyltransferases para produzir o complexo-tipo N-glycans, como usado pelos pesquisadores actuais, coloca mais procuras no metabolismo da pilha e reduz o crescimento da pilha.

Quando muito mais trabalho permanecer ser feito, in vitro glycoengineering pode ser do grande uso produzir antígenos vacinais potenciais e compreender como o glycosylation afecta a resposta imune. Totais, estas estratégias podiam ser usadas para produzir os glycoforms altamente personalizados para candidatos vacinais virais principais, incluindo plataformas como vírus ativados e atenuados, ou vírus-como partículas.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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