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¿Podía in vitro ayuda el glycoengineering producir a mejores candidatos del pico SARS-CoV-2 a la investigación vaccínea?

Un problema del disgusto en el revelado de vacunas ha sido la necesidad de lograr el perfil correcto del glycosylation para los antígenos virales. Un nuevo estudio, liberado recientemente como prueba preliminar en el servidor del bioRxiv*, muestra cómo una aproximación sin células secuencial produjo N-glycans complejo de tipos más simples, en una reacción del uno-pote.

Esto se podría utilizar obtener a rápidamente y fácilmente ninguno de un arsenal grande de N-glycans en candidatos vaccíneos potenciales del antígeno para realizar las juicios animales y la prueba preclínica, tales que es posible presentar su impacto en la inmunorespuesta y aumentar la eficacia de las vacunas de la subunidad de la proteína.

Glycosylation de la proteína

El Glycosylation de proteínas es crítico en la determinación de muchas características biológicas de una proteína, incluyendo su estructura, función, solubilidad, traficando dentro y a través de las membranas celulares y del atascamiento a los ligands. La distribución y la excreción de la composición, así como su conversión a otros metabilitos, son también relacionadas en gran parte en la adición de residuos glycosyl.

Cuando se trata de partículas virales, el glycosylation afecta a la agregación viral a las células huesped así como a la baja de las partículas del señuelo para desviar los anticuerpos y las células inmunes. El Glycosylation es también dominante al epitopo de la inmune-evasión que blinda, usando propio aparato del glycosylation de la célula.

Esto es un obstáculo importante para el revelado vaccíneo. Por otra parte, no apenas la presencia de N-glycans pero del glycoform sí mismo afecta al atascamiento del virus, de su infectiousness, de la antigenicidad y de la inmunogeneticidad. La semejanza lograda entre los antígenos y las proteínas immunodominant virales de la célula huesped por su perfil superficial del glycosylation se piensa para beneficiar al virus.

En el otro lado, los residuos glycosyl específicos se podían manipular para perfeccionar eficacia vaccínea, discuten a los investigadores. Ésta sigue siendo un área de la investigación abierta y en curso.

El perfil del glycosylation del pico SARS-CoV-2

El coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática es un virus con el ácido ribonucleico de una sola fila (ARN). Tiene tres proteínas inmunogenéticas de la membrana, el pico o la proteína de S, una proteína integral de la membrana y una proteína de envolvente, que comprenden su envolvente. La glicoproteína de S dedica el receptor de la enzima 2 de la célula huesped angiotensina-que convierte (ACE2) para lograr el asiento viral.

La proteína de S es pesado glycosylated, con sobre una muesca de los sitios del N-glycosylation, más que muchos otros virus.

In vitro glycoengineering

Estos residuos se estudian a menudo en variedades de células tales como las células de HEK, donde los perfiles únicos del glycosylation se producen en las proteínas. Esto requiere protocolos específicos ser utilizada con cada variedad de células distinta, haciéndolo trabajo-pesado.

Las glicoproteínas varían entre ellos mismos e incluso dentro de la misma clase, haciéndole un reto adicional para entender cómo dan forma exactamente la inmunorespuesta en los modelos animales.

Como opción eficiente, las técnicas para la producción de glycosyltransferases eucarióticos y bacterianos dentro de fijaciones sin células del uno-pote se han afilado cuidadosamente para permitir el tramitación glycan. Esto se puede utilizar para dirigir glycoforms en las proteínas, con independencia del sistema de la célula usado para la expresión de la proteína.

In vivo el oligomannose-tipo N-glycan Man5 es convertido en el complejo-tipo glycans por mannosidases y MGAT1, MGAT2 y GalT. Los substratos para estas reacciones son UDP-GlcNAc y UDP-galactosa, respectivamente. B) Este proceso se puede remodelar in vitro para sintetizar el complejo-tipo estructuras en las proteínas recombinantes célula-derivadas insecto con el paucimannose-tipo N-glycans, como Man3.
A) In vivo el oligomannose-tipo N-glycan Man5 es convertido en el complejo-tipo glycans por mannosidases y MGAT1, MGAT2 y GalT. Los substratos para estas reacciones son UDP-GlcNAc y UDP-galactosa, respectivamente. B) Este proceso se puede remodelar in vitro para sintetizar el complejo-tipo estructuras en las proteínas recombinantes célula-derivadas insecto con el paucimannose-tipo N-glycans, como Man3.

¿Cuáles son los resultados?

En el estudio actual, una reacción secuencial sin células del uno-pote fue utilizada a con éxito convierte el paucimannose-tipo fucosylated y afucosylated N-glycans al complejo-tipo N-glycans galactosylated.

El estudio actual combinó glycosyltransferases humanos recombinantes en una reacción sin células del uno-pote, puesto que se saben para ser expresados en Escherichia Coli y efectivo al glycosylate las proteínas recombinantes en esta fijación.

El estudio utilizó tres glycosyltransferases co-expresados en Escherichia Coli para convertir el simple típico, inferior-manosa, N-glycans del pico recombinante SARS-CoV-2 en las estructuras galactosyl-ricas complejas mamíferas clásicas.

Las conclusión indican que mannose-3-glycans, ambos con y sin el fucosylation, fueron convertidos en gran parte a los residuos galactosylated correspondientes.

Ocho de 22 sitios del N-glycosylation eran ricos en el oligomannose-tipo N-glycans, probablemente más debido a obstáculo estérico para las enzimas de tramitación glycan en las áreas de tramitación, bastante que debido a la variedad de células usada.

La proteína dirigida del pico en esta fijación tenía N-glycans galactosylated complejo abundante, con cierto híbrido y oligomannose-tipo N-glycans también. Sin embargo, el complejo-tipo N-glycans en ser humano célula-derivó las proteínas del pico también muestra residuos ácidos siálicos y las estructuras multi-antennary.

Usos in vitro de glycoengineering

El sistema de la expresión de la célula del insecto que utilizaron con la inoculación del baculovirus es capaz del tramitación eficiente de la proteína eucariótica, es fácilmente escalable y resulta una gran cantidad de proteína dirigida, haciéndole el ideal para la manufactura vaccínea de la subunidad de la proteína.

El glycoform producido en tales sistemas es muy distinto de ése producido en células mamíferas, en células de ese insecto exprese sobre todo la inferior-manosa N-glycans híbrido, pero el oligomannose-tipo último, complejo N-glycans. Sin embargo, las variantes puras del pico producidas en el estudio actual mostraron la última configuración, que es muy inusual para este sistema de la expresión.

Tres vacunas producidas por este camino se han autorizado ya, a saber, Flublok®, Cervarix® y Provenge®, contra gripe, el papillomavirus humano, y el cáncer de próstata. Mucho más, incluyendo alguno contra COVID-19, se están desarrollando.

Un ectodomain recombinante del pico producido por un sistema de la expresión de la célula del insecto se ha mostrado ya para ser muy inmunogenético en estudios del primate no humano. Usando esta tecnología, una vacuna de la subunidad de la proteína (RBD-Dimero) contra COVID-19 se aprueba actualmente en China. Las vacunas de Novavax y de Glaxo-Smith-Kline están aguardando la aprobación.

El uso de los glycans no humanos que incorporan el ácido o el α de N-glycolylneuraminic, residuos de la galactosa 1-3-linked podría aumentar la eficiencia de inmunorespuestas, pero más trabajo se requiere eliminar su alergenicidad.

Tomado junto, un recubrimiento importante del glycoform se ha generado. Si el recubrimiento es también sitio-específico queda investigar en futuro.”

¿Cuáles son las implicaciones?

La aproximación glycoengineering in vitro para producir el complejo-tipo N-glycans modificando variedades de células del insecto ofrece la independencia de la variedad de células del productor, y la flexibilidad creciente para permitir muchos diversos glycoforms si son estructural similares.  

La disponibilidad de los nucleótidos del azúcar, que son los substratos para este proceso, a los regímenes comerciales será dominante a upscaling esta tecnología.

El uso de las variedades de células transitorias del insecto, es una tal aproximación glycoengineering in vitro, pero su estabilidad en la producción en grande no se ha confirmado. Por otra parte, la expresión simultánea de los glycosyltransferases para producir el complejo-tipo N-glycans, según lo utilizado por los investigadores actuales, pone más demandas en el metabolismo de la célula y reduce incremento de la célula.

Mientras que sigue habiendo mucho más trabajo ser hecho, el glycoengineering in vitro puede ser de gran uso de producir los antígenos vaccíneos potenciales y de entender cómo el glycosylation afecta a la inmunorespuesta. Totales, estas estrategias se podían utilizar para producir los glycoforms altamente modificados para requisitos particulares para los candidatos vaccíneos virales de cabeza, incluyendo las plataformas como virus activados y atenuados, o las partículas de tipo virus.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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