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L'acido fosfatidico è un substrato comune chiave per epatite virale C e la replica SARS-CoV-2

Lo scoppio mondiale di coronavirus 2 (SARS-CoV-2), l'agente patogeno novello di sindrome respiratorio acuto severo responsabile della pandemia di malattia 2019 di coronavirus (COVID-19), ha stimolato la ricerca intensiva sulle droghe e sui vaccini antivirali potenziali.

Un nuovo studio, rilasciato come pubblicazione preliminare sul " server " del bioRxiv*, mette a fuoco sulla molecola del lipido chiamata acido fosfatidico (PA), mostrante il suo ruolo cruciale nella replica di questo virus e così il suo potenziale come obiettivo per intervento terapeutico.

Virus dell'epatite C contro SARS-CoV-2

Il virus dell'epatite C (HCV) è egualmente una peste di umanità, a causa della sua profonda tendenza a causare l'epatite cronica. Tuttavia, è abbastanza differente da SARS-CoV-2, avendo una gamma ristretta di host e un corso cronico, a differenza della malattia a breve termine veduta con gli ultimi ed il suo vasto tropismo ospite. Inoltre, HCV è un flavivirus, mentre SARS-CoV-2 è un coronavirus.

Ciò nonostante, entrambi sono simili nell'avere un singolo filo di acido ribonucleico chiamato materiale genetico (RNA). In entrambi i casi, la loro replica comprende la formazione di sacchi membranosi, chiamata vescicole della doppio membrana (DMVs), situate nel citoplasma.

Biogenesi di DMV

La formazione di questi DMVs è suscitata dalle interazioni della proteina del virale-host e mentre queste si accumulano in celle infettate, sono considerate come organelli della replica. Somigliano ai autophagosomes nel modulo esterno, ma mentre l'ultimo è destinato per inghiottire i detriti cellulari per scomporrli, al servire virale di DMVs di fornitura del luogo sicuro per la replica virale del RNA.

DMVs è prodotto dal reticolo endoplasmatico (ER) della cellula ospite, in risposta alle proteine non strutturali virali. Lo studio corrente ha cercato di identificare i substrati comuni utilizzati da entrambi i virus nella fase della replica.

In HCV, il DMVs è stato trovato per essere composto di acyltransferase 1 (AGPAT) e 2 del acylglycerolphosphate, di cui tutt'e due sono stati trovati per accelerare la sintesi di PA

Acido fosfatidico

L'acido fosfatidico (PA) è la molecola che forma l'elemento di base dei Di e triacilgliceroli come pure tutti i glycerophospholipids. È egualmente una molecola di segnalazione ed incorpora le nuove proteine nelle membrane. Con il suo gruppo capo altamente fatto pagare, induce le membrane a curvare.

Questi beni di PA sembrano essere importanti per formazione di DMV, piombo i ricercatori mettere a fuoco su AGPATs. Questi enzimi sono conosciuti per essere essenziali per il metabolismo dei lipidi normale nell'organismo e quando sono alterati, i disordini seri del polmone e neurologici sono conosciuti per accadere.

Dei 11 AGPATs in celle del mammifero, AGPAT1 e 2 sono stati trovati per partecipare alla sintesi di PA, facendo uso dei gruppi dell'acile da acido lysophosphatidic (LPA). L'espulsione di AGPAT1 e di 2 causati simultaneamente formazione difficile della gocciolina del lipido. Quando soltanto uno è stato tramortito, la replica di HCV è stata diminuita vicino intorno 50-70%, mentre una doppia espulsione piombo alla replicazione virale più bassa di 90%.

Quando la replica subgenomic del RNA è stata esaminata, la replica ancora più è stata diminuita. Questi risultati hanno indicato che il sito di effetto di AGPAT era replica virale del RNA. Quando entrambi questi enzimi sono stati espressi ai livelli stabili, la replica ha ritornato ai livelli normali. Ciò non era il caso se neanche fosse inattivo.

Questo tipo di inibizione non è stato veduto con il virus di febbre rompiossa o il virus di Zika, altri due flaviviruses che causano i invaginations del ER piuttosto che la formazione di DMV.

Requisito di AGPATAs dadi formazione di DMV e da dadi PA indotti HCV. capitalizzazione da su DMVs indotto HCV e sulle strutture in relazione con autophagy. (A C) a AGPAT1/2 DKO inumidisce la formazione di DMV indotta da HCV. Le celle di Huh7-derived che esprimono stabile il RNA polimerasi T7 e contenere o non una doppia espulsione di AGPAT1 e di 2 transfected con un plasmide della codifica di HCV replicase-589 che contiene un
Requisito di AGPATAs dadi formazione di DMV e da dadi PA indotti HCV. capitalizzazione da su DMVs indotto HCV e sulle strutture in relazione con autophagy. (A C) a AGPAT1/2 DKO inumidisce la formazione di DMV indotta da HCV. Le celle di Huh7-derived che esprimono stabile il RNA polimerasi T7 e contenere o non una doppia espulsione (DKO) di AGPAT1 e di 2 transfected con un plasmide della codifica di HCV replicase-589 che contiene un'inserzione di GFP in NS5A (pTM NS3-3' /5A-GFP della costruzione, comitato superiore). Le trascrizioni sono generate dal plasmide nel citoplasma via la sequenza del promotore T7 e del terminatore (T7-term) e il HCV NS3 - la sequenza codificante 5B è tradotta via le IRE del virus dell'encefalomiocardite (EMCV). (A) Dopo 24 h, le celle erano fisse e sottoposte a CLEM. Le immagini confocali di microscopia di risoluzione bassa che identificano le celle transfected sono indicate sul sinistro superiore. La casella di area in rosso è indicata nell'immagine corrispondente di EM. Le teste gialle della freccia indicano DMVs. Le inserzioni al fondo indicano le regioni zummate. (B) DMVs all'interno di intere sezioni delle cellule è stato contato e diviso stato da area delle cellule (µm2). Il grafico mostra la media e la deviazione standard da 4 celle transfected differenti. Le celle che esprimono il livello comparabile di replicase di HCV sono state selezionate per l'analisi di EM. Il significato è stato calcolato da una t-prova accoppiata. **, p<0.01. (C) i livelli di espressione di NS4B e di NS5A in celle transfected sono stati determinati dal macchiare occidentale. (D) analisi di Lipidome da di DMVs indotto HCV. Gli estratti di celle Huh7 che contengono le celle subgenomic sg4BHA31R (NS4B-HA) e Huh7 del replicone che overexpressing stabile le celle Ha-etichettate di Calnexin (CNX-HA) e di controllo Huh7 sono stati preparati come descritto nei metodi supplementari e sono stati usati per depurazione di Ha-affinità nelle circostanze indigene. Un'aliquota del campione è stata analizzata da microscopia elettronica (comitati superiori) mentre la maggioranza è stata sottoposta all'analisi del lipidome usando la spettrometria di massa. I valori ottenuti per il campione di NS4B-HA sono stati normalizzati a quelli ottenuti per il campione di CNX-HA che è stato collocato ad uno. La lista completa dei lipidi analizzati è riassunta nei dati S3. (E) capitalizzazione di PA a NS5A che contiene le strutture. Le celle Huh7-Lunet/T7 transfected con una costruzione analoga a quella in comitato A, ma contenere un'inserzione mCherry invece di GFP, con un wildtype EGFP-etichettato (WT) o (4E) un sensore mutante di PA (costruzione pTM612 EGFP-PABD-Raf1-WT o -4E). I ventiquattro ore più successivamente, GFP-PABD e NS5A-mCherry sono stati visualizzati da microscopia di fluorescenza. Le caselle bianche indicano le regioni ingrandette nella destra più bassa di ogni comitato. (F) comitato superiore: Vie alterne di biosintesi di PA via acido lysophosphatidic (LPA) o la fosfatidilcolina (PC) catalizzata da AGPATs o da PLDs, rispettivamente. Comitato inferiore: Le celle Huh7-Lunet/T7 electroporated con le trascrizioni in vitro di un replicone subgenomic del reporter di HCV che codifica il luciferase della lucciola. Quattro ore dopo la transfezione, le concentrazioni differenti di inibitori della sintesi di PA si sono aggiunte alle celle e le attività di luciferase sono state analizzate a 48 h dopo l'elettroporazione. Il grafico mostra la media e la deviazione standard da 3 esperimenti indipendenti. L'attuabilità delle cellule determinata mediante l'analisi luminescente di CellTiter-Glo è indicata con la linea rossa. (G) assunzione di PA alle strutture in relazione con autophagy in autophagy selettivo e non selettivo. Comitato superiore: Le celle di Huh7-derived che esprimono EGFP623 PABD-Raf-1 sono state incubate nel media della crescita (comitati sinistri superiori) o nel media senza siero con 200 il nanometro BafA1 (comitati di destra superiore) per 3 celle del H. erano fisso e macchiato con un anticorpo specifico LC3. Comitato inferiore: Per Parkin autophagy e mCherry-etichettato selettivo era co626 espresso con EGFP-PABD-Raf1, seguito da incubazione con un Valinomycin di 10 µM per indurre mitophagy. Le celle erano fisse dopo 3 h e GFP-PABD e il mCherry-Parkin sono stati visualizzati da microscopia di fluorescenza. Le immagini in comitati E e G sono proiezioni massime dell'intensità.

L'inibizione di formazione di DMV sopprime la replicazione virale

Hanno trovato che il meccanismo di inibizione di replica del RNA in HCV era impedendo la formazione di DMV. Cioè mentre gli alti livelli del frammento NS3-5B di poliproteico di HCV piombo a formazione abbondante di DMV in celle di controllo, questo è stato impedito in larga misura dalla doppia espulsione di AGPAT1 e di 2.

Inoltre, il DMVs che è stato formato era più piccolo di diametro. Quindi, AGPATs è chiave alla formazione di DMVs in vivo. Questo DMVs è ricco di colesterolo e di sphingolipids come pure di PA, confrontato alle membrane di ER.

Facendo uso delle proteine contrassegnate per individuare il PA all'interno degli unicellulari, è stato evidente che il PA è trovato in collaborazione con NS4B all'interno delle celle infettate produttivamente da HCV. Secondariamente, egualmente hanno trovato che indotto da virus la capitalizzazione di PA ai punti che contengono NS5A.

Questi risultati indicano che il PA è reclutato ai siti della replica di HCV, mediati da AGPAT1 e da 2.

Vie alternative di inibizione di PA

Gli effetti di inibizione di altri enzimi che potrebbero svolgere un ruolo nella generazione di PA, quali gli enzimi D1 (PLD1) e D2 (PLD2) della fosfolipasi, egualmente sono stati esaminati.

Di tre inibitori usati, soltanto uno, PLD2 un inibitore, replica soppressa senza causare citotossicità. Tuttavia, questo egualmente indica che il PA è richiesto per l'infezione produttiva con HCV via formazione di DMV, che supporta la replica di RNA virale.

Di nuovo, hanno trovato che il PA è richiesto per formazione autophagosome. Tuttavia, una terza via che comprende il PA, via la chinasi di diacylglycerol (DAGK), non è risultata strumentale nella formazione di questi organelli.

Inibizione di SARS-CoV-2-induced DMVs

Sia da da DMVs indotto HCV che dai autophagosomes morfologicamente simili dipenda sia da AGPAT1 che da 2 come pure la presenza di PA, lo studio è stata estesa per esaminare la partecipazione di questi enzimi nella formazione di organelli della replica di SARS-CoV-2 pure, poiché queste egualmente ripiegano in DMVs. In questo caso, DMVs è agglutinato insieme alle membrane complicate ed al ER zippered per formare gli organelli della replica.

I risultati indicano che AGPAT1 e 2 sono accumulati ai siti biogenetici di DMV, con le proteine non strutturali nsp3, quale sono probabilmente i siti della replica virale del RNA. Ciò era indipendente dal rimescolamento drastico delle proteine di ER dopo l'infezione SARS-CoV-2, come indicato tramite la distribuzione intatta di altre proteine di ER.

Similmente, l'espulsione di AGPAT1 e/o 2 hanno causato una profonda soppressione dell'infezione SARS-CoV-2 nella coltura cellulare, indicante la replicazione virale diminuita. Ciò non era dovuto la diminuzione nell'abbondanza di nsp3-5n virale; nessuno era là una riduzione del numero di DMVs ha indotto da nsp3-4 - a differenza di quello osservato con HCV.

Invece, c'erano alterazioni nella struttura della membrana, quali il ER zippered e DMVs con una media più di diametro basso di 145 nanometro. le vescicole della Multi-membrana (MMVs) sono state trovate nell'abbondanza aumentata in queste celle, indicanti che le strutture anormali della membrana stavano formande.

Il PA è essenziale per la replica SARS-CoV-2

La replica SARS-CoV-2 è stata influenzata meno drammaticamente che quella osservata con HCV e l'assenza di AGPAT1 e di 2 in celle infettate con il precedente ha indotto il modulo del DMVs indotto nsp3-4 a cambiare. Tuttavia, AGPATs ancora si è accumulato ai siti in cui i cluster di SARS-CoV-2-induced DMV sono stati localizzati.

Ciò potrebbe significare che le vie alternative di biosintesi di PA erano attive nel permettere la formazione di DMV e la replica SARS-CoV-2. I ricercatori hanno confermato questo aggiungendo gli inibitori della sintesi di PA da altri lipidi, compreso il LPA. Ciò ha mostrato una riduzione dipendente dalla dose della replica SARS-CoV-2 sotto le concentrazioni citotossiche delle droghe.

Il migliore effetto è stato veduto con le combinazioni di inibitori, in cui la replicazione virale è stata diminuita ripidamente senza citotossicità. Con tutte le droghe, la capitalizzazione di PA è stata diminuita ai siti di formazione di DMV e questi organelli erano egualmente contrassegnato più piccoli. Questo effetto è stato osservato con gli inibitori di AGPAT, di PLD1 e di DAGK.

Tuttavia, l'inibizione PLD2 piombo alla formazione di più alto numero di MMVs ed egualmente ha aumentato il diametro di DMV, come con l'espulsione di AGPAT. Quindi, questo indica che il PA è richiesto per formazione di DMV e la replica normali del RNA nell'infezione SARS-CoV-2.

Che cosa sono le implicazioni?

Così SARS-CoV-2 e HCV entrambi modulo DMVs basato su una molecola comune del lipido e sulla biogenesi di PA egualmente sembra essere richiesto per DMVs che somiglia ai autophagosomes. Ciò significa che DMVs cellulare è prodotto in modo analogo a DMVs virale e che entrambi sono promossi dalle vie multiple.

I meccanismi differenti per l'atto di PA nella formazione virale di DMV sono proposti. Potrebbe essere che la forma di cono del lipido promuove la curvatura della membrana, predisponente a formazione di DMV. Secondariamente, il ruolo svolto tramite PA nella fissione della membrana può essere collegato con la biogenesi di DMV. Per concludere, può partecipare ad una catena del contro-trasporto, in cui è scambiato per un altro lipido.

L'acido fosfatidico è importante per la formazione di doppie vescicole della membrana, servente da organelli della replica del virus dell'epatite C e di SARS-CoV-2 ed offrente un host possibile che mira alla strategia per trattare l'infezione SARS-CoV-2.„

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Sorgente

 

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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