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O ácido Phosphatidic é uma carcaça comum chave para a réplica C e SARS-CoV-2 da hepatite

A manifestação mundial do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), o micróbio patogénico novo responsável para a pandemia da doença 2019 do coronavirus (COVID-19), estimulou a pesquisa intensiva em drogas e em vacinas antivirosas potenciais.

Um estudo novo, liberado como uma pré-impressão no server do bioRxiv*, focaliza na molécula do lipido chamada ácido phosphatidic (PA), mostrando seu papel crucial na réplica deste vírus, e assim seu potencial como um alvo para a intervenção terapêutica.

Vírus da hepatite C contra SARS-CoV-2

O vírus da hepatite C (HCV) é igualmente um praga da humanidade, devido a sua propensão marcada causar a hepatite crônica. Contudo, é bastante diferente de SARS-CoV-2, tendo uma escala estreita dos anfitriões e um curso crônico, ao contrário da doença a curto prazo vista com os últimos, e seu tropismo largo do anfitrião. Além disso, HCV é um flavivirus, quando SARS-CoV-2 for um coronavirus.

Todavia, ambos são semelhantes em ter uma única costa do material genético chamada ácido ribonucléico (RNA). Em ambos os casos, sua réplica envolve a formação de sacos membranosos, chamada as vesículas da dobro-membrana (DMVs), situadas no citoplasma.

Biogénese de DMV

A formação destes DMVs é induzida por interacções da proteína do viral-anfitrião, e como estes se acumulam em pilhas contaminadas, são considerados ser organelles da réplica. Assemelham-se a autophagosomes no formulário externo, mas visto que o último é significado tragar restos celulares para os quebrar para baixo, ao saque viral de DMVs a finalidade de fornecer um lugar seguro para a réplica viral do RNA.

DMVs é produzido do segundo estômago endoplasmic (ER) da pilha de anfitrião, em resposta às proteínas não-estruturais virais. O estudo actual procurou identificar as carcaças comuns utilizadas por ambos os vírus durante o processo de réplica.

Em HCV, o DMVs foi encontrado para ser compor do acyltransferase 1 (AGPAT) e 2 do acylglycerolphosphate, ambo forams para acelerado a síntese do PA

Ácido Phosphatidic

O ácido Phosphatidic (PA) é molécula que forma o bloco de apartamentos básico de di e tri-acylglycerols assim como todos os glycerophospholipids. É igualmente uma molécula da sinalização e incorpora proteínas novas nas membranas. Com seu grupo principal altamente carregado, faz com que as membranas curvem-se.

Estas propriedades do PA parecem ser importantes para a formação de DMV, conduzindo os pesquisadores focalizar em AGPATs. Estas enzimas são sabidas para ser essenciais para o metabolismo de lipido normal no corpo, e quando são danificadas, as desordens sérias neurológicas e do pulmão são sabidas para ocorrer.

Dos 11 AGPATs em pilhas do mamífero, AGPAT1 e 2 foram encontrados para ser envolvidos na síntese do PA, usando grupos do acílico do ácido lysophosphatidic (LPA). O KO de AGPAT1 e de 2 causados simultaneamente a formação deficiente da gota do lipido. Quando somente um foi batido para fora, a réplica de HCV foi reduzida perto ao redor 50-70%, quando um KO dobro conduziu a uma mais baixa réplica viral de 90%.

Quando a réplica subgenomic do RNA foi examinada, a réplica foi reduzida ainda mais. Estes resultados mostraram que o local do efeito de AGPAT era réplica viral do RNA. Quando ambas estas enzimas foram expressadas a níveis estáveis, a réplica retornou aos níveis normais. Este não era o caso se era tampouco inactivo.

Este tipo de inibição não foi considerado com vírus de dengue ou vírus de Zika, outros dois flaviviruses que causam invaginations do ER um pouco do que a formação de DMV.

Exigência de AGPATAs para a formação de DMV e o PA HCV-induzidos. acumulação em DMVs HCV-induzido e em estruturas autophagy-relacionadas. (A C) a AGPAT1/2 DKO umedece a formação de DMV induzida por HCV. As pilhas de Huh7-derived que expressam estàvel a polimerase e a contenção de RNA T7 ou não um nocaute dobro de AGPAT1 e de 2 transfected com um plasmídeo da codificação de HCV replicase-589 que contem uma inserção de GFP em NS5A (pTM NS3-3
Exigência de AGPATAs para a formação de DMV e o PA HCV-induzidos. acumulação em DMVs HCV-induzido e em estruturas autophagy-relacionadas. (A C) a AGPAT1/2 DKO umedece a formação de DMV induzida por HCV. As pilhas de Huh7-derived que expressam estàvel a polimerase e a contenção de RNA T7 ou não um nocaute dobro (DKO) de AGPAT1 e de 2 transfected com um plasmídeo da codificação de HCV replicase-589 que contem uma inserção de GFP em NS5A (pTM NS3-3' /5A-GFP da construção, painel superior). Os transcritos são gerados do plasmídeo no citoplasma através da seqüência do promotor T7 e do terminal (T7-term) e do HCV NS3 - a região da codificação 5B é traduzida através dos IRES do vírus do encephalomyocarditis (EMCV). (a) Após 24 h, as pilhas eram fixas e sujeitadas a CLEM. As imagens confocal da microscopia da baixa definição que identificam pilhas transfected são mostradas à esquerda o superior esquerdo. A área na caixa vermelha é mostrada na imagem correspondente do EM. As cabeças amarelas da seta indicam DMVs. Inserir na parte inferior indicam zumbir-em regiões. (b) DMVs dentro das secções inteiras da pilha foi contado e dividido pela área da pilha (µm2). O gráfico mostra a média e o SD de 4 pilhas transfected diferentes. As pilhas que expressam o nível comparável de replicase de HCV foram seleccionadas para a análise do EM. O significado foi calculado por um t-teste emparelhado. **, p<0.01. (c) Os níveis da expressão de NS4B e de NS5A em pilhas transfected foram determinados pela mancha ocidental. (d) Análise de Lipidome de DMVs HCV-induzido. Os extractos das pilhas Huh7 que contêm as pilhas sg4BHA31R (NS4B-HA) e Huh7 subgenomic do replicon que overexpressing estàvel pilhas HA-etiquetadas de Calnexin (CNX-HA) e de controle Huh7 foram preparados como descrito em métodos suplementares e usados para a purificação da HA-afinidade sob circunstâncias nativas. Uma parte alíquota da amostra foi analisada pela microscopia de elétron (painéis superiores) visto que a maioria foi sujeitada à análise do lipidome usando a espectrometria em massa. Os valores obtidos para a amostra de NS4B-HA foram normalizados àqueles obtidos para a amostra de CNX-HA que foi ajustada a uma. A lista completa de lipidos analisados é resumida nos dados S3. (e) Acumulação do PA em NS5A que contem estruturas. As pilhas Huh7-Lunet/T7 transfected com uma construção análoga a essa no painel A, mas contenção de uma inserção mCherry no lugar de GFP, junto com um sensor EGFP-etiquetado (WT) do PA do wildtype ou do mutante (4E) (construção pTM612 EGFP-PABD-Raf1-WT ou -4E). Twenty-four horas mais tarde, GFP-PABD e NS5A-mCherry foram visualizados pela microscopia de fluorescência. As caixas brancas indicam as regiões ampliadas no direito mais baixo de cada painel. (f) Painel superior: Caminhos alternativos da biosíntese do PA através do ácido lysophosphatidic (LPA) ou do phosphatidylcholine (PC) catalisado por AGPATs ou por PLDs, respectivamente. Painel inferior: As pilhas Huh7-Lunet/T7 electroporated com in vitro transcritos de um replicon subgenomic do repórter de HCV que codifica o luciferase do vaga-lume. Quatro horas após o transfection, as concentrações diferentes de inibidores da síntese do PA foram adicionadas às pilhas e as actividades do luciferase foram analisadas em 48 h após o electroporation. O gráfico mostra a média e o SD de 3 experiências independentes. A viabilidade da pilha determinada pelo ensaio luminescente de CellTiter-Glo é indicada com a linha vermelha. (g) Recrutamento do PA às estruturas autophagy-relacionadas em autophagy selectivo e não-selectivo. Painel superior: As pilhas de Huh7-derived que expressam EGFP623 PABD-Raf-1 foram incubadas no media do crescimento (painéis do superior esquerdo) ou no media soro-livre com 200 nanômetro BafA1 (painéis do direito superior) para 3 pilhas do H. eram fixo e manchado com um anticorpo do específico LC3. Painel inferior: Para Parkin autophagy, mCherry-etiquetado selectivo era co626 expressado com o EGFP-PABD-Raf1, seguido pela incubação com o Valinomycin de 10 µM para induzir mitophagy. As pilhas eram fixas após 3 h, e GFP-PABD e o mCherry-Parkin foram visualizados pela microscopia de fluorescência. As imagens nos painéis E e G são projecções máximas da intensidade.

A inibição de formação de DMV suprime a réplica viral

Encontraram que o mecanismo da inibição de réplica do RNA em HCV era impedindo a formação de DMV. Isto é, quando os níveis elevados do fragmento NS3-5B do polyprotein de HCV conduziram à formação abundante de DMV em pilhas do controle, isto foi impedido em grande parte pelo KO dobro de AGPAT1 e de 2.

Além, o DMVs que foi formado era menor no diâmetro. Assim, AGPATs é chave à formação de DMVs in vivo. Este DMVs é rico no colesterol e nos sphingolipids, assim como no PA, comparado às membranas do ER.

Usando proteínas etiquetadas para detectar o PA dentro das únicas pilhas, tornou-se claro que o PA está encontrado em colaboração com NS4B dentro das pilhas contaminadas produtiva por HCV. Em segundo lugar, igualmente encontraram que vírus-induzido a acumulação de PA nos pontos que contêm NS5A.

Estes resultados mostram que o PA está recrutado aos locais da réplica de HCV, negociados por AGPAT1 e por 2.

Caminhos alternativos da inibição do PA

Os efeitos da inibição de outras enzimas que poderiam jogar um papel na geração do PA, tal como as enzimas D1 (PLD1) e D2 do phospholipase (PLD2), foram examinados igualmente.

De três inibidores usados, somente um, PLD2 um inibidor, réplica suprimida sem causar a citotoxidade. Contudo, isto igualmente indica que o PA está exigido para a infecção produtiva com o HCV através da formação de DMV, que apoia a réplica do RNA viral.

Além disso, encontraram que o PA está exigido para a formação autophagosome. Contudo, um terceiro caminho que envolve o PA, através da quinase do diacylglycerol (DAGK), não foi encontrado para ser instrumental na formação destes organelles.

Inibição de SARS-CoV-2-induced DMVs

Desde que DMVs HCV-induzido e os autophagosomes morfològica similares são dependentes de AGPAT1 e de 2, assim como da presença de PA, o estudo foi estendido para examinar também a participação destas enzimas na formação de organelles da réplica de SARS-CoV-2, desde que estes igualmente replicate em DMVs. Neste caso, DMVs é aglutinado junto com as membranas complicadas e o ER zippered para formar os organelles da réplica.

Os resultados mostram que AGPAT1 e 2 estão acumulados em locais biogenéticos de DMV, junto com as proteínas não-estruturais nsp3, quais são provavelmente os locais da réplica viral do RNA. Este era independente do reshuffling drástico de proteínas do ER depois da infecção SARS-CoV-2, como mostrado pela distribuição intacto de outras proteínas do ER.

Similarmente, o KO de AGPAT1 e/ou 2 causaram uma supressão marcada da infecção SARS-CoV-2 na cultura celular, indicando a réplica viral reduzida. Isto não era devido à diminuição na abundância de nsp3-5n viral; nenhum era lá uma redução no número de DMVs induziu por nsp3-4 - ao contrário daquele observado com HCV.

Em lugar de, havia umas alterações na estrutura da membrana, tal como o ER zippered e o DMVs com uma média mais de pequeno diâmetro de 145 nanômetro. as vesículas da Multi-membrana (MMVs) foram encontradas na abundância aumentada nestas pilhas, indicando que as estruturas anormais da membrana estavam formadas.

O PA é essencial para a réplica SARS-CoV-2

A réplica SARS-CoV-2 foi afectada menos dramàtica do que aquela observada com HCV, e a ausência de AGPAT1 e de 2 nas pilhas contaminada com o anterior fez com que o formulário do DMVs induzido nsp3-4 mudasse. Contudo, AGPATs ainda acumulou nos locais onde os conjuntos de SARS-CoV-2-induced DMV foram localizados.

Isto poderia significar que os caminhos alternativos da biosíntese do PA eram activos em permitir a formação de DMV e a réplica SARS-CoV-2. Os pesquisadores confirmaram este adicionando os inibidores da síntese do PA de outros lipidos, incluindo o LPA. Isto mostrou uma redução dependente da dose na réplica SARS-CoV-2 abaixo das concentrações citotóxicos das drogas.

O melhor efeito foi considerado com combinações de inibidores, onde a réplica viral foi reduzida íngreme sem citotoxidade. Com todas as drogas, a acumulação do PA foi reduzida nos locais da formação de DMV, e estes organelles eram igualmente marcada menores. Este efeito foi observado com os inibidores de AGPAT, de PLD1, e de DAGK.

Contudo, a inibição PLD2 conduziu à formação de um número mais alto de MMVs e igualmente aumentou o diâmetro de DMV, como com KO de AGPAT. Assim, isto indica que o PA está exigido para a formação de DMV e a réplica normais do RNA na infecção SARS-CoV-2.

Que são as implicações?

Assim SARS-CoV-2 e HCV ambos formulário DMVs baseado em uma molécula comum do lipido, e na biogénese do PA igualmente parecem ser exigidos para DMVs que assemelha-se a autophagosomes. Isto significa que DMVs celular está produzido de forma semelhante a DMVs viral, e que ambos estão promovidos por caminhos múltiplos.

Os mecanismos diferentes para a acção do PA na formação viral de DMV são propor. Poder-se-ia ser que a forma de cone do lipido promove a curvatura da membrana, predispor à formação de DMV. Em segundo lugar, o papel jogado pelo PA na fissão da membrana pode ser relacionado à biogénese de DMV. Finalmente, pode participar em uma corrente do contador-transporte, onde seja trocado por um outro lipido.

O ácido Phosphatidic é importante para a formação de vesículas dobro da membrana, servindo como os organelles da réplica do vírus da hepatite C e do SARS-CoV-2, e oferecendo um anfitrião possível que visa a estratégia para tratar a infecção SARS-CoV-2.”

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

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Journal reference:
Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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