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El ácido fosfatídico es un substrato común dominante para la réplica C y SARS-CoV-2 de la hepatitis

El brote mundial del coronavirus 2 (SARS-CoV-2), el patógeno nuevo de la neumonía asiática responsable del pandémico de la enfermedad 2019 del coronavirus (COVID-19), ha estimulado la investigación intensiva en las drogas y las vacunas antivirus potenciales.

Un nuevo estudio, liberado como prueba preliminar en el servidor del bioRxiv*, se centra en la molécula del lípido llamada ácido fosfatídico (PA), mostrando su papel crucial en la réplica de este virus, y así su potencial como objetivo para la intervención terapéutica.

Virus de la hepatitis C comparado con SARS-CoV-2

El virus de la hepatitis C (HCV) es también una plaga de la humanidad, debido a su propensión marcada a causar hepatitis crónica. Sin embargo, es muy diferente de SARS-CoV-2, teniendo un estrecho rango de ordenadores principal y un curso crónico, a diferencia de la enfermedad a corto plazo vista con estes último, y su tropismo amplio del ordenador principal. Por otra parte, HCV es un flavivirus, mientras que SARS-CoV-2 es un coronavirus.

No obstante, ambos son semejantes en tener un único cabo del material genético llamado ácido ribonucleico (ARN). En ambos casos, su réplica implica la formación de sacos membranosos, llamada las vesículas de la doble-membrana (DMVs), situadas en el citoplasma.

Biogénesis de DMV

La formación de estos DMVs es sacada por acciones recíprocas de la proteína del viral-ordenador principal, y como éstas se acumulan en células infectadas, se consideran ser organelos de la réplica. Se asemejan a autophagosomes en forma exterior, pero mientras que este último se significa para engullir los escombros celulares para romperlos hacia abajo, al servicio viral de DMVs el propósito de ofrecer un lugar seguro para la réplica viral del ARN.

DMVs se produce del retículo endoplásmico (ER) de la célula huesped, en respuesta a las proteínas no-estructurales virales. El estudio actual intentó determinar los substratos comunes utilizados por ambos virus durante el proceso de la réplica.

En HCV, el DMVs fue encontrado para ser compuesto del acyltransferase 1 (AGPAT) y 2 del acylglycerolphosphate, que fueron encontrados para acelerar la síntesis del PA

Ácido fosfatídico

El ácido fosfatídico (PA) es la molécula que forma el bloque hueco básico de di y los triacilgliceroles así como todos los glycerophospholipids. Es también una molécula de la transmisión de señales e incorpora las nuevas proteínas en las membranas. Con su grupo principal altamente cargado, hace las membranas curvar.

Estas propiedades del PA parecen ser importantes para la formación de DMV, llevando a los investigadores a centrarse en AGPATs. Estas enzimas se saben para ser esenciales para el metabolismo de lípido normal en la carrocería, y cuando se empeoran, los desordenes neurológicos y del pulmón serios se saben para ocurrir.

De los 11 AGPATs en células del mamífero, AGPAT1 y 2 fueron encontrados para ser implicados en síntesis del PA, usando grupos del acil del ácido lysophosphatidic (LPA). El golpe de gracia de AGPAT1 y 2 causados simultáneamente la formación pobre de la gotita del lípido. Cuando solamente uno fue eliminado, la réplica de HCV fue reducida cerca alrededor 50-70%, mientras que un golpe de gracia doble llevó hasta una réplica viral más inferior del 90%.

Cuando la réplica subgenomic del ARN fue examinada, la réplica fue reducida aún más. Estas conclusión mostraron que el sitio del efecto de AGPAT era réplica viral del ARN. Cuando ambas estas enzimas fueron expresadas en los niveles estables, la réplica volvió a los niveles normales. Éste no era el caso si tampoco estaba inactivo.

Este tipo de inhibición no fue considerado con el virus de dengue o el virus de Zika, dos otros flaviviruses que causan los invaginations del ER bastante que la formación de DMV.

Requisito de AGPATAs para la formación de DMV y el PA HCV-inducidos. acumulación en DMVs HCV-inducido y las estructuras autophagy-relacionadas. (A C) a AGPAT1/2 DKO humedece la formación de DMV inducida por HCV. Las células de Huh7-derived que expresaban estable la polimerasa y contener de ARN T7 o no un golpe de gracia doble de AGPAT1 y 2 transfected con un plásmido de la codificación de HCV replicase-589 que contenía una inserción de GFP en NS5A (pTM NS3-3
Requisito de AGPATAs para la formación de DMV y el PA HCV-inducidos. acumulación en DMVs HCV-inducido y las estructuras autophagy-relacionadas. (A C) a AGPAT1/2 DKO humedece la formación de DMV inducida por HCV. Las células de Huh7-derived que expresaban estable la polimerasa y contener de ARN T7 o no un golpe de gracia doble (DKO) de AGPAT1 y 2 transfected con un plásmido de la codificación de HCV replicase-589 que contenía una inserción de GFP en NS5A (pTM NS3-3' /5A-GFP de la construcción, panel superior). Las transcripciones se generan del plásmido en el citoplasma vía la serie y el HCV NS3 del promotor T7 y del adaptador (T7-term) - la región de la codificación 5B se traduce vía las IRAS del virus de la encefalomiocarditis (EMCV). (a) Después de 24 h, las células eran fijas y sujetadas a CLEM. Las imágenes confocales de la microscopia de la resolución inferior que determinan las células transfected se muestran en el izquierdo superior. El área en la caja roja se muestra en la imagen correspondiente del EM. Las culatas de cilindro amarillas de la flecha indican DMVs. Las inserciones en la parte inferior indican empinadura-en regiones. (b) DMVs dentro de secciones enteras de la célula fue contado y dividido por el área de la célula (µm2). El gráfico muestra promedio y el SD a partir de 4 diversas células transfected. Las células que expresaban el nivel comparable de replicase de HCV fueron seleccionadas para el análisis del EM. La significación era calculada por una t-prueba emparejada. **, p<0.01. (c) Los niveles de la expresión de NS4B y de NS5A en células transfected fueron determinados por borrar occidental. (d) Análisis de Lipidome de DMVs HCV-inducido. Los extractos de las células Huh7 que contenían las células subgenomic sg4BHA31R (NS4B-HA) y Huh7 del réplicón overexpressing estable las células Ha-marcadas con etiqueta de Calnexin (CNX-HA) y del mando Huh7 fueron preparados según lo descritos en métodos suplementarios y utilizados para la purificación de la Ha-afinidad bajo condiciones nativas. Una parte alícuota de la muestra era analizada por la microscopia electrónica (paneles superiores) mientras que sujetaron a la mayoría al análisis del lipidome usando la espectrometría de masa. Los valores obtenidos para la muestra de NS4B-HA fueron normalizados a ésos obtenidos para la muestra de CNX-HA que fue fijada a una. El filete completo de lípidos analizados se resume en los datos S3. (e) Acumulación del PA en NS5A que contiene las estructuras. Las células Huh7-Lunet/T7 transfected con una construcción análoga a la que está en el panel A, pero contener una inserción mCherry en lugar de GFP, junto con un sensor EGFP-marcado con etiqueta (WT) del PA del wildtype o del mutante (4E) (construcción pTM612 EGFP-PABD-Raf1-WT o -4E). Veinticuatro horas más adelante, GFP-PABD y NS5A-mCherry fueron visualizados por microscopia de fluorescencia. Las cajas blancas indican las regiones magnificadas en la derecha más inferior de cada panel. (f) Panel superior: Caminos alternos de la biosíntesis del PA vía el ácido lysophosphatidic (LPA) o la fosfatidilcolina (PC) catalizada por AGPATs o PLDs, respectivamente. Panel inferior: Las células Huh7-Lunet/T7 electroporated con las transcripciones ines vitro de un réplicón subgenomic del reportero de HCV que codificaba el luciferase de la luciérnaga. Cuatro horas después de la transfección, diversas concentraciones de inhibidores de la síntesis del PA fueron agregadas a las células y las actividades del luciferase eran analizadas en 48 h después de la electroporación. El gráfico muestra promedio y el SD a partir de 3 experimentos independientes. La viabilidad de la célula determinada por el análisis luminiscente de CellTiter-Glo se indica con la línea roja. Reclutamiento del PA del (G) a las estructuras autophagy-relacionadas en autophagy selectivo y no selectivo. Panel superior: Las células de Huh7-derived que expresaban EGFP623 PABD-Raf-1 fueron incubadas en el ambiente del incremento (paneles izquierdos superiores) o en ambiente sin suero con 200 nanómetro BafA1 (paneles del superior derecho) para 3 células del H. eran fijo y manchado con un anticuerpo del específico LC3. Panel inferior: Para Parkin autophagy, mCherry-marcado con etiqueta selectivo era co626 expresado con EGFP-PABD-Raf1, seguido por la incubación con Valinomycin de 10 µM para inducir mitophagy. Las células eran fijas después de 3 h, y GFP-PABD y el mCherry-Parkin fueron visualizados por microscopia de fluorescencia. Las imágenes en los paneles E y G son proyecciones máximas de la intensidad.

La inhibición de la formación de DMV suprime la réplica viral

Encontraron que el mecanismo de la inhibición de la réplica del ARN en HCV estaba previniendo la formación de DMV. Es decir, mientras que los niveles del fragmento NS3-5B del polyprotein de HCV llevaron a la formación abundante de DMV en células del mando, esto fue prevenida en gran parte por el golpe de gracia doble de AGPAT1 y 2.

Además, el DMVs que fue formado era más pequeño en diámetro. Así, AGPATs es dominante a la formación de DMVs in vivo. Este DMVs es rico en colesterol y sphingolipids, así como el PA, comparado a las membranas del ER.

Usando las proteínas etiqueta para descubrir el PA dentro de células, se ponía de manifiesto que el PA está encontrado en asociación con NS4B dentro de las células infectadas productivo por HCV. En segundo lugar, también encontraron que inducido por virus la acumulación de PA en los puntos que contenían NS5A.

Estas conclusión muestran que el PA está reclutado a los sitios de la réplica de HCV, mediados por AGPAT1 y 2.

Caminos alternativos de la inhibición del PA

Los efectos de la inhibición de otras enzimas que podrían desempeñar un papel en la generación del PA, tal como enzimas D1 (PLD1) y D2 (PLD2) de la fosfolipasa, también fueron examinados.

De tres inhibidores usados, solamente uno, PLD2 un inhibidor, réplica suprimida sin causar citotoxicidad. Sin embargo, esto también indica que el PA está requerido para la infección productiva con HCV vía la formación de DMV, que soporta la réplica del ARN viral.

Una vez más encontraron que el PA está requerido para la formación autophagosome. Sin embargo, un tercer camino que implicaba el PA, vía la cinasa del diacylglycerol (DAGK), no fue encontrado para ser instrumental en la formación de estos organelos.

Inhibición de SARS-CoV-2-induced DMVs

Puesto que DMVs HCV-inducido y los autophagosomes morfológicamente similares son relacionados en AGPAT1 y 2, así como la presencia de PA, el estudio fue ampliado para examinar la implicación de estas enzimas en la formación de organelos de la réplica de SARS-CoV-2 también, puesto que éstos también repliegan en DMVs. En este caso, DMVs se agrupa así como las membranas enrolladas y el ER zippered para formar los organelos de la réplica.

Las conclusión muestran que AGPAT1 y 2 están acumulados en los sitios biogenéticos de DMV, junto con las proteínas no-estructurales nsp3, cuáles son probablemente los sitios de la réplica viral del ARN. Ésta era independiente de la modificación drástica de las proteínas del ER después de la infección SARS-CoV-2, como se muestra por la distribución intacta de otras proteínas del ER.

Semejantemente, el golpe de gracia de AGPAT1 y/o 2 causaron una supresión marcada de la infección SARS-CoV-2 en cultivo celular, indicando la réplica viral reducida. Esto no era debido a la disminución de la abundancia de nsp3-5n viral; ninguno estaba allí una reducción en el número de DMVs indujo por nsp3-4 - a diferencia de eso observada con HCV.

En lugar, había cambios en la estructura de la membrana, tal como ER zippered y DMVs con un promedio más de diámetro bajo de 145 nanómetro. las vesículas de la Multi-membrana (MMVs) fueron encontradas en abundancia creciente en estas células, indicando que las estructuras anormales de la membrana eran formadas.

El PA es esencial para la réplica SARS-CoV-2

La réplica SARS-CoV-2 fue afectada menos dramáticamente que lo observada con HCV, y la ausencia de AGPAT1 y 2 en células infectada con el anterior hizo la forma del DMVs inducido nsp3-4 cambiar. Sin embargo, AGPATs todavía acumuló en los sitios en donde los atados de SARS-CoV-2-induced DMV fueron localizados.

Esto podría significar que los caminos alternativos de la biosíntesis del PA eran activos en permitir la formación de DMV y la réplica SARS-CoV-2. Los investigadores confirmaron esto agregando los inhibidores de la síntesis del PA de otros lípidos, incluyendo el LPA. Esto mostró una reducción dosis-relacionada en la réplica SARS-CoV-2 abajo de las concentraciones citotóxicas de las drogas.

El mejor efecto fue considerado con combinaciones de los inhibidores, donde la réplica viral fue reducida escarpado sin citotoxicidad. Con todas las drogas, la acumulación del PA fue reducida en los sitios de la formación de DMV, y estos organelos eran también marcado más pequeños. Este efecto fue observado con los inhibidores de AGPAT, de PLD1, y de DAGK.

Sin embargo, la inhibición PLD2 llevó a la formación de un número más elevado de MMVs y también aumentó el diámetro de DMV, como con golpe de gracia de AGPAT. Así, esto indica que el PA está requerido para la formación normal de DMV y la réplica del ARN en la infección SARS-CoV-2.

¿Cuáles son las implicaciones?

Así SARS-CoV-2 y HCV ambo forma DMVs basado en una molécula común del lípido, y biogénesis del PA también parece ser requerido para DMVs que se asemeja a autophagosomes. Esto significa que DMVs celular está producido de la misma manera a DMVs viral, y que ambos son ascendidos por caminos múltiples.

Diversos mecanismos para la acción del PA en la formación viral de DMV se proponen. Podría ser que la forma de cono del lípido asciende la curvatura de la membrana, predisponiendo a la formación de DMV. En segundo lugar, el papel desempeñado por el PA en la fisión de la membrana se puede relacionar con la biogénesis de DMV. Finalmente, puede participar en una cadena del contratirante-transporte, donde se intercambia para otro lípido.

El ácido fosfatídico es importante para la formación de vesículas dobles de la membrana, sirviendo como organelos de la réplica del virus de la hepatitis C y de SARS-CoV-2, y ofreciendo un ordenador principal posible que apunta estrategia para tratar la infección SARS-CoV-2.”

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Fuente

 

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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