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L'ordonnancement de Nanopore contredit l'intégration de génome humain de SARS-CoV-2

Le coronavirus 2 (SARS-CoV-2), l'agent causal de syndrôme respiratoire aigu sévère de la pandémie actuelle de la maladie 2019 de coronavirus (COVID-19), est un virus avec un génome d'acide ribonucléique (ARN).

Récent, le coronavirus proposé 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère de Zhang et autres détourne les machines (L1) de la rétrotransposition LINE-1 pour intégrer dans l'ADN des cellules infectées.

Maintenant un rapport de recherche neuf de prétirage posté au serveur de bioRxiv* écarte la possibilité, augmentée par cette étude, que le virus insère son matériel génétique dans le génome de la cellule hôte.

Mouvement propre

Ce virus manque d'une enzyme de transcriptase inverse, qui est exigée pour convertir l'ARN en sa boucle complémentaire de l'acide désoxyribonucléique (ADN). Par conséquent, SARS-CoV-2 ne comporte pas son matériel génétique à l'ADN génomique humain pendant son cycle de vie d'infection.

C'est une supposition essentielle qui est à la base des techniques diagnostiques actuelles utilisées pour cette infection et pour ses conséquences à long terme potentielles. Il y a d'autres virus, tels que le virus de l'immunodéficience humaine 1 (HIV-1) et le virus de la hépatite B (HBV), qui intègrent avec l'ADN et entraînent la transformation cancéreuse ou l'infection chronique.

Toutes les cellules mammifères ont les rétrotransposons (L1) LINE-1 en leurs génomes. Ceci provoque l'ARN messager (ARNm) qui code deux protéines exigées pour le mouvement de L1. Celles-ci sont représentées comme ORF1p et ORF2p.

L'ORF2p agit en tant qu'endonucléase ainsi que transcriptase inverse (RT), avec une forte tendance de catalyser la transcription inverse du L1 ARNm. Il peut également mobiliser l'ARN cellulaire, qui transporte un arrière polyadenylated, y compris l'ARN d'autres rétrotransposons et des gènes codant des protéines.

La dernière activité est occasionnelle, cependant, probablement parce qu'elle est supprimée par la cellule. En fait, moins qu'une mise en place unique d'ARN cellulaire devrait se produire selon 2.000 mises en place L1.

Les deux types de mises en place sont marqués par des duplications de site d'objectif (TSDs) et une région polyA de 3 ′, se produisant L1 au ′ de la séquence 5 - TTTT/AA. Ces signes aident à recenser des mises en place vraies.

Une preuve plus tôt

Plus tôt, des cellules de SARS-CoV-2-infected avec L1 overexpressed ont été montrées pour contenir l'ADN identique à l'ARN viral. Ceci a été ajouté à l'autre plus faible preuve de montrer l'intégration de l'ARN SARS-CoV-2 dans le génome de cellule hôte.

Ceci a été suivi de l'identification de 63 séquences supposées intégrées de SARS-CoV-2 par le même chercheur, utilisant un ordonnancement appelé de ordonnancement de long-Read de technologies d'Oxford (ONT) Nanopore de technique. Seulement un de ces derniers a été enjambé par un ontario affiché, sur le chromosome X, qui a montré TSDs potentiel de chaque côté, et celui-ci a manqué de la région prévue de polyA de 3 ′.

D'ailleurs, une omission de 28 kb a semblé s'être produite de la séquence virale. Les exons étaient 26 le fois enrichi dans ces integrants, une conclusion qui ne peut pas être expliquée par la préférence de l'enzyme L1.

La deuxième étude a été suivie d'encore des des autres, utilisant l'ordonnancement de court-Read d'Illumina. Ceci a été prétendu montrer aux jonctions prétendues où les séquences SARS-CoV-2 ont été jointes au génome d'hôte en cellules manquant des hauts niveaux de L1.

D'autres évaluations

Cependant, s'affiche n'a pas enjambé la séquence intégrée. De nouveau, la préparation d'une bibliothèque pour l'ordonnancement d'Illumina est connue pour tendre vers le rétablissement de corps étrangers. Ces faits laissent la conclusion dans le doute.

Plus tôt, cependant, les scientifiques responsables de l'ontario utilisé par prétirage actuel s'affiche pour trouver la transcription inverse de L1-dependent des génomes viraux. Un exemple est la constitution de deux séquences (HCV) de virus Hépatite C dans un échantillon de tumeur de foie.

D'ailleurs, la plate-forme de cellules utilisée pour l'ontario ordonnançant, à savoir, des cellules de HEK293T, a beaucoup de caractéristiques qui peuvent le rendre facile d'évaluer le cas de telles séquences virales inverse-transcrites. Par exemple, ces cellules expriment le L1 ORF1p, ont été habituées à recevoir les rétrotransposons L1 insérés, et servent à supporter l'infection SARS-CoV-2 productive.

Objectif d'étude

Utilisant l'ontario ordonnançant, l'étude actuelle a essayé d'analyser l'ADN génomique de cette lignée cellulaire après l'infection de elles avec SARS-CoV-2 aux doses multiples. Les cellules de contrôle étaient les lignées cellulaires de tumeur et de non-tumeur d'un positif de tumeur de foie pour le virus de la hépatite B.

L'ontario ordonnançant des caractéristiques des études plus tôt ont été ajoutés. En tant que contrôles négatifs, les cellules VHC-positives précédemment recensées de carcinome de foie ont été employées, avec les cellules de foie normales.

Dépistage de rétrotransposition endogène de L1-mediated en cellules humaines. a, plan d
Dépistage de rétrotransposition endogène de L1-mediated en cellules humaines. a, plan d'expérience. Des cellules de HEK- 293T ont été divisées en deux populations (cultivars), qui étaient alors infectées infecté ou faux de l'un ou l'autre de SARS-CoV-2. L'ADN a été extrait de chaque cultivar, ainsi que des échantillons patients de carcinome hépatocellulaire, et soumis à l'ordonnancement d'ontario. L'ontario s'affiche ont été employés pour appeler la non-référence L1 et les mises en place de virus avec TLDR, qui résout également TSDs et d'autres cachets de rétrotransposition. TSDs : triangles rouges ; région de polyA : rectangle vert ; Ontario affiché : rectangle bleu. Note : quelques illustrations sont adaptées d'Ewing et d'al.23 b, distribution de grandeurs de DST pour des mises en place de la non-référence L1, comme annoté par TLDR. c, quant à b, excepté montrer des caractéristiques pour les mises en place L1 trouvées seulement en nos cellules de HEK293T infectées avec SARS-CoV-2 ou nos fausses cellules infectées. d, caractérisation détaillée d'une mise en place L1 trouvée en cellules infectées de SARS-CoV-2 HEK293T par un ontario de enjambement unique s'est affiché aligné sur le chromosome 14. Les nucléotides ont mis en valeur en rouge correspondent au site DST d'intégration. Les nucléotides soulignés correspondent au motif d'en L1. La bande dessinée indique une mise en place intégrale de L1HS flanquée de TSDs (triangles rouges), et une région de la polyA 3ʹ (vert). Les numéraux représentent des positions relativement à la séquence L1.346 de L1HS. L'ontario de enjambement approprié affiché, avec l'identificateur, est positionné sous la bande dessinée. Les symboles (α, β, δ, γ) représentent la position environ des amorces utilisées des réactions de validation d'ACP pour site vide/rempli et de L1-genome jonction. Les images de gel manifestent les résultats des ces PCRs. Les tailles de bande d'échelle sont comme indiquées, NTC ; contrôle de non-matrice. Les triangles rouges indiquent la taille prévue des amplicons L1 (triangle vide : aucun produit observé ; triangle remplie : produit observé). Les triangles bleues indiquent des tailles vides prévues de site. e, quant à d, excepté un 5ʹ inversé/a effacé L1HS situé sur le chromosome 18.

Aucune mises en place trouvées

Toutes ces séquences prétendu intégrées se sont analysées pour recenser toutes les mises en place L1 spécifiques pour des cellules humaines, enjambé par au moins un fil d'ontario aligné sur un seul lieu. Pas une mise en place unique n'a été trouvée des génomes de SARS-CoV-2, de VHC ou de VHB.

Cependant, le programme a recensé 575 mises en place L1 avec le TSDs flanquant. Soixante-dix-huit étaient seul aux cellules de SARS-CoV-2-infected ou aux contrôles moquerie-infectés, la majorité enjambée par un unique affichés.

Parmi ces mises en place de unique-enjambement, six, qui ont été choisis au hasard pour vérifier et confirmation de manuel par un test (PCR) d'amplification en chaîne par polymérase, ont été confirmés pour montrer chacune des trois caractéristiques d'une mise en place L1 vraie.

Deuxièmement, les chercheurs ont constaté que le programme pourrait récupérer une séquence intégrée par VHB unique.

Cependant, il n'a pas montré que la présence de n'importe quel ontario s'affiche qui pourrait aligner sur les génomes de SARS-CoV-2 ou de VHC, prouvant que des rétrotransposons et les mises en place des virus exogènes sont sûrement discernés.

Ceci a été suivi de la découverte que les caractéristiques d'ontario de la première étude ont contenu 555 s'affichent qui pourraient être alignés sur le génome SARS-CoV-2. Un de ces derniers s'affiche était la séquence intégrée putative sur le chromosome X qui n'a pas eu un 3' région de polyA.

La moyenne longueur de ces derniers s'affiche était, cependant, comparée trop court à l'ensemble de données général. Plus de la moitié de ces derniers s'affiche se sont composés SARS-CoV-2 de séquence, à séquences relatives de forte proportion un L1 dans s'affiche qui ont été alignés sur L1.

Le programme n'a pas appelé les integrants prétendus du génome SARS-CoV-2. Ainsi, en dépit de la présence de s'affiche qui pourrait être alignée sur le génome viral dans l'ensemble de données de l'étude plus tôt, ceux-ci s'affiche étaient comparés trop court au typique affichée. Ainsi, les chercheurs postulent que ceux-ci pourraient être les corps étrangers moléculaires incorrectement interprétés en tant que séquences intégrées par SARS-CoV-2.

Ces résultats indiquent la capacité de l'ontario de enjambement unique s'affiche pour trouver des rétrotransposons et pour montrer les mises en place L1 endogènes dans cette lignée cellulaire qui a manqué de L1 overexpressed.

Quelle est la conclusion ?

« En somme, nous n'observons pas l'intégration génomique de L1-mediated SARS-CoV-2 en cellules de HEK293T, en dépit de la disponibilité des machines L1. »

La raison est que le L1 préfère clairement s'inverser transcrit son propre ARNm plutôt que SARS-CoV-2. Ainsi, bien que possible, c'est probablement un phénomène rare, comme avec autre poly-UN-coussinet RNAs cellulaire.

« Ce nous avons trouvé aucune preuve de l'intégration SARS-CoV-2 ne propose que de tels événements soient in vivo hautement peu susceptibles de piloter l'oncogénèse postérieure ou d'expliquer le dépistage de goujon-guérison du virus. »

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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