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L'ordinamento di Nanopore contraddice l'integrazione del genoma umano di SARS-CoV-2

Il coronavirus 2 (SARS-CoV-2), l'agente causativo di sindrome respiratorio acuto severo della pandemia in corso di malattia 2019 di coronavirus (COVID-19), è un virus con un genoma dell'acido ribonucleico (RNA).

Recentemente, Zhang et al. ha proposto il coronavirus di sindrome respiratorio acuto severo 2 dirottamenti (SARS-CoV-2) il macchinario (L1) di retrotransposition LINE-1 per integrare nel DNA delle celle infettate.

Ora una nuova pubblicazione della pubblicazione preliminare inviata al " server " del bioRxiv* allontana la possibilità, sollevata di quello studio, che il virus inserisce il suo materiale genetico nel genoma della cellula ospite.

Sfondo

Questo virus manca di un enzima inverso di transcriptase, che è richiesto per convertire il RNA in suo filo complementare dell'acido desossiribonucleico (DNA). Di conseguenza, SARS-CoV-2 non comprende il suo materiale genetico nel DNA genomico umano durante il suo ciclo di vita di infezione.

Ciò è un presupposto cruciale che è alla base delle tecniche diagnostiche correnti usate per questa infezione e per le sue conseguenze a lungo termine potenziali. Ci sono altri virus, quali il virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) ed il virus dell'epatite B (HBV), che integrano con DNA e causano la trasformazione cancerogena o l'infezione cronica.

Tutte le cellule di mammiferi hanno retrotransposoni (L1) LINE-1 in loro genoma. Ciò provoca il RNA messaggero (mRNA) che codifica due proteine richieste per il movimento di L1. Questi sono rappresentati come ORF1p e ORF2p.

Il ORF2p funge da endonucleasi come pure transcriptase inverso (RT), con una forte tendenza a catalizzare la trascrizione inversa del L1 mRNA. Può anche mobilizzare il RNA cellulare, che porta una coda polyadenylated, compreso RNA da altri retrotransposoni e dai geni che codificano le proteine.

L'attività posteriore è rara, tuttavia, probabilmente perché è soppressa dalla cella. Infatti, di meno che una singola inserzione cellulare del RNA dovrebbe accadere per 2.000 inserzioni L1.

Entrambi i tipi di inserzioni sono tracciati dalle duplicazioni del sito dell'obiettivo (TSDs) e da una regione di polyA di 3 ′, accadente L1 al ′ di sequenza 5 - TTTT/AA. Questi segni contribuiscono ad identificare le inserzioni vere.

Prova più iniziale

Più presto, le celle di SARS-CoV-2-infected con L1 overexpressed sono state indicate per contenere il DNA identico a RNA virale. Ciò è stata accoppiata con l'altra prova più debole per dimostrare l'integrazione di RNA SARS-CoV-2 nel genoma della cellula ospite.

Ciò è stata seguita dall'identificazione di 63 sequenze supposte integrate da SARS-CoV-2 dallo stesso ricercatore, facendo uso di una tecnica d'ordinamento chiamata ordinamento del a lungo read delle tecnologie (ONT) di Oxford Nanopore. Soltanto uno di questi è stato misurato da un Ontario colto, sul cromosoma X, che ha mostrato TSDs potenziale da qualsiasi lato e questo mancava del tratto previsto di polyA di 3 ′.

Inoltre, un'eliminazione di KB 28 è sembrato accadere dalla sequenza virale. Gli esoni erano 26 volta arricchita in questi integrants, un'individuazione che non può essere spiegata dalla preferenza dell'enzima L1.

Il secondo studio è stato seguito da ancora un altro, facendo uso dell'ordinamento del breve read di Illumina. Ciò è stata reclamata per mostrare a giunzioni presunte dove le sequenze SARS-CoV-2 si sono unite al genoma ospite in celle che mancano degli alti livelli di L1.

Altre interpretazioni

Tuttavia, legge non ha misurato la sequenza integrata. Di nuovo, il preparato di una libreria per l'ordinamento di Illumina è conosciuto per tendere verso la generazione del artefatto. Questi fatti lasciano la conclusione nel dubbio.

Più presto, tuttavia, gli scienziati responsabili dell'Ontario usato pubblicazione preliminare corrente legge per individuare la trascrizione inversa di L1-dependent dei genoma virali. Un esempio è l'incorporazione di due sequenze (HCV) del virus dell'epatite C in un campione del tumore del fegato.

Inoltre, la piattaforma delle cellule utilizzata per l'Ontario che ordina, vale a dire, le celle di HEK293T, ha molte funzionalità che possono renderla facile valutare l'avvenimento di tali sequenze virali inverso-trascritte. Per esempio, queste celle esprimono il L1 ORF1p, sono state usate per accettare i retrotransposoni inseriti L1 e serviscono a supportare l'infezione produttiva SARS-CoV-2.

Scopo di studio

Facendo uso dell'Ontario che ordina, lo studio corrente ha tentato di analizzare il DNA genomico da questa linea cellulare dopo l'infezione loro con SARS-CoV-2 alle dosi multiple. Le celle di controllo erano le linee cellulari del non tumore e del tumore da un positivo del tumore del fegato per il virus dell'epatite B.

L'Ontario che ordina i dati dagli studi più iniziali si è aggiunto. Come comandi negativi, le celle HCV-positive precedentemente identificate di carcinoma del fegato sono state usate, con le celle di fegato normali.

Rilevazione del retrotransposition endogeno di L1-mediated in cellule umane. a, progettazione sperimentale. Le celle di HEK- 293T sono state divise in due popolazioni (cultivar), che erano poi qualsiasi SARS-CoV-2 infettati o falso infettate. Il DNA è stato estratto da ogni cultivar come pure dai campioni pazienti di carcinoma epatocellulare ed è stato sottoposto all
Rilevazione del retrotransposition endogeno di L1-mediated in cellule umane. a, progettazione sperimentale. Le celle di HEK- 293T sono state divise in due popolazioni (cultivar), che erano poi qualsiasi SARS-CoV-2 infettati o falso infettate. Il DNA è stato estratto da ogni cultivar come pure dai campioni pazienti di carcinoma epatocellulare ed è stato sottoposto all'ordinamento di Ontario. L'Ontario legge è stato usato per chiamare il non riferimento L1 e le inserzioni del virus con TLDR, che egualmente risolve TSDs ed altri marchi di garanzia di retrotransposition. TSDs: triangoli rossi; tratto di polyA: rettangolo verde; Ontario colto: rettangolo blu. Nota: alcune illustrazioni si adattano da Ewing et da al.23 la b, distribuzione per ampiezza di DST per le inserzioni di non riferimento L1, come annotato da TLDR. la c, per quanto riguarda la b, eccetto la mostra dei dati per le inserzioni L1 trovate soltanto nelle nostre celle di HEK293T infettate con SARS-CoV-2 o nella nostra derisione ha infettato le celle. la d, caratterizzazione dettagliata di un'inserzione L1 individuata in celle di HEK293T infettate SARS-CoV-2 da un singolo Ontario di misurazione ha letto allineato al cromosoma 14. I nucleotidi hanno evidenziato nel rosso corrispondono al sito DST di integrazione. I nucleotidi sottolineati corrispondono al motivo dell'en L1. Il fumetto indica un'inserzione integrale di L1HS fiancheggiata da TSDs (triangoli rossi) e un tratto di polyA 3ʹ (verde). I numeri rappresentano le posizioni riguardante la sequenza L1.346 di L1HS. L'Ontario di misurazione pertinente colto, con l'identificatore, è posizionato al di sotto del fumetto. I simboli (α, β, δ, γ) rappresentano la posizione approssimativa delle mani di fondo utilizzate per sito vuoto/riempito e le reazioni di convalida di PCR della giunzione di L1-genome. Le immagini del gel video i risultati dei questi PCRs. Le dimensioni della banda della scala sono come indicate, NTC; controllo del non modello. I triangoli rossi indicano la dimensione prevista L1 dei amplicons (triangolo vuoto: nessun prodotto osservato; triangolo riempito: prodotto osservato). I triangoli blu indicano le dimensioni vuote previste del sito. la e, per quanto riguarda la d, eccezione fatta per un 5ʹ invertito/ha cancellato L1HS situato sul cromosoma 18.

Nessun inserzioni trovate

Tutte queste sequenze presunto integrate sono state analizzate per identificare tutte le inserzioni L1 specifiche per le cellule umane, misurato tramite almeno un cavo di Ontario stato allineato ad un luogo unico. Non una singola inserzione è stata individuata dai genoma di SARS-CoV-2, di HCV o di HBV.

Tuttavia, il programma ha identificato 575 inserzioni L1 con il TSDs di fiancheggiamento. Settantotto era unico alle celle di SARS-CoV-2-infected o ai comandi derisione-infettati, la maggioranza misurata da un singolo colti.

Fra queste inserzioni di misurazione, sei, che sono stati scelti a caso per il controllo e la conferma del manuale da una prova di reazione a catena (PCR) della polimerasi, sono stati confermati per mostrare tutte e tre le funzionalità di un'inserzione vera L1.

Secondariamente, i ricercatori hanno trovato che il programma potrebbe recuperare una sola sequenza integrata HBV.

Tuttavia, non ha mostrato che la presenza di tutto l'Ontario legge che potrebbe allineare ai genoma di HCV o di SARS-CoV-2, indicando che i retrotransposoni e le inserzioni dai virus esogeni sono distinti attendibilmente.

Ciò è stata seguita dalla scoperta che i dati di Ontario dal primo studio hanno contenuto 555 leggono che potrebbero essere stati allineati al genoma SARS-CoV-2. Uno di questi legge era la sequenza integrata presunta sul cromosoma X che non ha avuto un 3' tratto di polyA.

La lunghezza media di questi legge era troppo breve, tuttavia, confrontato al gruppo di dati globale. Più della metà di questi legge sono stati composti SARS-CoV-2 di sequenza, alle le sequenze relative di proporzione elevata un L1 in legge che sono stati stati allineati a L1.

Il programma non è riuscito ad chiamare i integrants presunti dal genoma SARS-CoV-2. Quindi, malgrado la presenza di legge che potrebbe essere stata allineata al genoma virale nel gruppo di dati dello studio più iniziale, questi legge erano troppo breve confrontato al tipico colta. Quindi, i ricercatori postulano che questi potrebbero essere artefatti molecolari interpretati scorrettamente come sequenze integrate SARS-CoV-2.

Questi risultati indicano l'abilità di singolo Ontario di misurazione legge per individuare i retrotransposoni e per mostrare le inserzioni endogene L1 in questa linea cellulare che mancava di L1 overexpressed.

Che cosa è la conclusione?

In somma, non osserviamo l'integrazione genomica di L1-mediated SARS-CoV-2 in celle di HEK293T, malgrado la disponibilità del macchinario L1.„

La ragione è che il L1 preferisce chiaramente invertire trascrive il suo proprio mRNA piuttosto che SARS-CoV-2. Quindi, sebbene possibile, questo sia probabilmente un fenomeno raro, come con altro poli-UN-cuscinetto RNAs cellulare.

Quel abbiamo trovato nessuna prova di integrazione SARS-CoV-2 suggerisce che tali eventi in vivo fossero altamente improbabili da determinare l'oncogenesi successiva o da spiegare la rilevazione di post-ripristino del virus.„

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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