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Arranjar em seqüência de Nanopore contradiz a integração do genoma humano de SARS-CoV-2

O coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), o agente causal da pandemia em curso da doença 2019 do coronavirus (COVID-19), é um vírus com um genoma do ácido ribonucléico (RNA).

Recentemente, Zhang props e outros o coronavirus da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2 desvios de avião (SARS-CoV-2) a maquinaria (L1) do retrotransposition LINE-1 integrar no ADN de pilhas contaminadas.

Agora um artigo de investigação novo da pré-impressão afixado ao server do bioRxiv* demite a possibilidade, levantada por esse estudo, que o vírus introduz seu material genético no genoma de pilha de anfitrião.

Fundo

Este vírus falta uma enzima reversa do transcriptase, que seja exigida para converter o RNA em sua costa complementar do ácido deoxyribonucleic (ADN). Conseqüentemente, SARS-CoV-2 não incorpora seu material genético no ADN genomic humano durante seu ciclo de vida da infecção.

Esta é uma suposição crucial que seja a base das técnicas diagnósticas actuais usadas para esta infecção e para suas conseqüências a longo prazo potenciais. Há outros vírus, tais como o vírus de imunodeficiência humana 1 (HIV-1) e o vírus da hepatite B (HBV), que integram com ADN e causam a transformação cancerígeno ou a infecção crônica.

Todas as pilhas mamíferas têm os retrotransposons (L1) LINE-1 em seus genomas. Isto causa o RNA de mensageiro (mRNA) que codifica duas proteínas exigidas para o movimento de L1. Estes são representados como ORF1p e ORF2p.

O ORF2p actua como um endonuclease assim como um transcriptase reverso (RT), com uma tendência forte catalisar a transcrição reversa do L1 mRNA. Pode igualmente mobilizar o RNA celular, que leva uma cauda polyadenylated, incluindo o RNA de outros retrotransposons e dos genes que codificam proteínas.

A última actividade é rara, contudo, provavelmente porque é suprimida pela pilha. De facto, menos do que uma única inserção celular do RNA deve ocorrer por 2.000 inserções L1.

Ambos os tipos de inserções são marcados por duplicações do local do alvo (TSDs) e por uma região de polyA de 3 ′, ocorrendo L1 no ′ da seqüência 5 - TTTT/AA. Estes sinais ajudam a identificar inserções verdadeiras.

Evidência mais adiantada

Mais cedo, as pilhas de SARS-CoV-2-infected com L1 overexpressed foram mostradas para conter o ADN idêntico ao RNA viral. Isto foi acoplado com a outra evidência mais fraca para provar a integração do RNA SARS-CoV-2 no genoma da pilha de anfitrião.

Isto foi seguido pela identificação de 63 seqüências supor integradas de SARS-CoV-2 pelo mesmo pesquisador, usando uma técnica arranjando em seqüência chamada arranjar em seqüência do longo-read das tecnologias (ONT) de Oxford Nanopore. Somente um destes foi medido por um Ontário lido, no cromossoma de X, que mostrou TSDs potencial de cada lado, e este faltou o intervalo previsto do polyA de 3 ′.

Além disso, um supressão de 28 kb pareceu ter ocorrido da seqüência viral. Os Exons eram 26 a dobra enriquecida nestes integrants, encontrar que não pode ser explicado pela preferência da enzima L1.

O segundo estudo foi seguido por imóvel outro, usando arranjar em seqüência do curto-read de Illumina. Isto foi reivindicado mostrar a junções supostas onde as seqüências SARS-CoV-2 foram juntadas ao genoma do anfitrião nas pilhas que faltam níveis elevados de L1.

Outras interpretações

Contudo, lê não mediu a seqüência integrada. Além disso, a preparação de uma biblioteca para arranjar em seqüência de Illumina é sabida para tender para a geração do produto manufacturado. Estes factos deixam a conclusão na dúvida.

Mais cedo, contudo, os cientistas responsáveis para pré-impressão actual o Ontário usado lêem para detectar a transcrição reversa de L1-dependent de genomas virais. Um exemplo é a incorporação de duas seqüências do vírus da hepatite (HCV) C em uma amostra do tumor do fígado.

Além disso, a plataforma da pilha usada para o Ontário que arranja em seqüência, a saber, pilhas de HEK293T, tem muitas características que podem o fazer fácil avaliar a ocorrência de tais seqüências virais reverso-transcritas. Por exemplo, estas pilhas expressam o L1 ORF1p, foram usadas para aceitar os retrotransposons L1 introduzidos, e servir-lo para apoiar a infecção SARS-CoV-2 produtiva.

Alvo do estudo

Usando o Ontário que arranja em seqüência, o estudo actual tentou analisar o ADN genomic desta linha celular após ter contaminado os com o SARS-CoV-2 em doses múltiplas. As pilhas do controle eram o tumor e as linha celular do não-tumor de um positivo do tumor do fígado para o vírus da hepatite B.

O Ontário que arranja em seqüência dados dos estudos mais adiantados foi adicionado. Como controles negativos, as pilhas HCV-positivas previamente identificadas da carcinoma do fígado foram usadas, junto com pilhas de fígado normais.

Detecção de retrotransposition endógeno de L1-mediated em pilhas humanas. a, projecto experimental. As pilhas de HEK- 293T foram divididas em duas populações (cultivars), que eram então um ou outro SARS-CoV-2 contaminados ou trocistas contaminadas. O ADN foi extraído de cada cultivar, assim como das amostras pacientes da carcinoma hepatocelular, e sujeitado a arranjar em seqüência do Ontário. O Ontário lê foi usado para chamar a não-referência L1 e as inserções do vírus com TLDR, que igualmente resolve TSDs e outras indicações do retrotransposition. TSDs: triângulos vermelhos; intervalo do polyA: retângulo verde; Ontário lido: retângulo azul. Nota: algumas ilustrações são adaptadas de Ewing e de al.23 b, distribuição de tamanho do TSD para inserções da não-referência L1, como anotadas por TLDR. c, quanto para a b, exceto mostrar dados para as inserções L1 encontradas somente em nossas pilhas de HEK293T contaminadas com SARS-CoV-2 ou em nossa zombaria contaminou pilhas. d, caracterização detalhada de uma inserção L1 detectada em pilhas contaminadas SARS-CoV-2 de HEK293T por um único Ontário de medida leu alinhado ao cromossoma 14. Os Nucleotides destacaram no vermelho correspondem ao local TSD da integração. Os nucleotides sublinhados correspondem ao motivo do EN L1. Os desenhos animados indicam uma inserção completo de L1HS flanqueada por TSDs (triângulos vermelhos), e um intervalo do polyA 3ʹ (verde). Os numerais representam posições relativo à seqüência L1.346 de L1HS. O Ontário de medida relevante lido, com identificador, é posicionado debaixo dos desenhos animados. Os símbolos (α, β, δ, γ) representam a posição aproximada das primeiras demão usadas para local vazio/enchido e da junção de L1-genome reacções da validação do PCR. As imagens do gel indicam os resultados dos estes PCRs. Os tamanhos da faixa da escada são como indicados, NTC; controle do não-molde. Os triângulos vermelhos indicam o tamanho previsto dos amplicons L1 (triângulo vazio: nenhum produto observado; triângulo enchido: produto observado). Os triângulos azuis indicam tamanhos vazios previstos do local. e, quanto para a d, à exceção de um 5ʹ invertido/suprimiu de L1HS situado no cromossoma 18.
Detecção de retrotransposition endógeno de L1-mediated em pilhas humanas. a, projecto experimental. As pilhas de HEK- 293T foram divididas em duas populações (cultivars), que eram então um ou outro SARS-CoV-2 contaminados ou trocistas contaminadas. O ADN foi extraído de cada cultivar, assim como das amostras pacientes da carcinoma hepatocelular, e sujeitado a arranjar em seqüência do Ontário. O Ontário lê foi usado para chamar a não-referência L1 e as inserções do vírus com TLDR, que igualmente resolve TSDs e outras indicações do retrotransposition. TSDs: triângulos vermelhos; intervalo do polyA: retângulo verde; Ontário lido: retângulo azul. Nota: algumas ilustrações são adaptadas de Ewing e de al.23 b, distribuição de tamanho do TSD para inserções da não-referência L1, como anotadas por TLDR. c, quanto para a b, exceto mostrar dados para as inserções L1 encontradas somente em nossas pilhas de HEK293T contaminadas com SARS-CoV-2 ou em nossa zombaria contaminou pilhas. d, caracterização detalhada de uma inserção L1 detectada em pilhas contaminadas SARS-CoV-2 de HEK293T por um único Ontário de medida leu alinhado ao cromossoma 14. Os Nucleotides destacaram no vermelho correspondem ao local TSD da integração. Os nucleotides sublinhados correspondem ao motivo do EN L1. Os desenhos animados indicam uma inserção completo de L1HS flanqueada por TSDs (triângulos vermelhos), e um intervalo do polyA 3ʹ (verde). Os numerais representam posições relativo à seqüência L1.346 de L1HS. O Ontário de medida relevante lido, com identificador, é posicionado debaixo dos desenhos animados. Os símbolos (α, β, δ, γ) representam a posição aproximada das primeiras demão usadas para local vazio/enchido e da junção de L1-genome reacções da validação do PCR. As imagens do gel indicam os resultados dos estes PCRs. Os tamanhos da faixa da escada são como indicados, NTC; controle do não-molde. Os triângulos vermelhos indicam o tamanho previsto dos amplicons L1 (triângulo vazio: nenhum produto observado; triângulo enchido: produto observado). Os triângulos azuis indicam tamanhos vazios previstos do local. e, quanto para a d, à exceção de um 5ʹ invertido/suprimiu de L1HS situado no cromossoma 18.

Nenhumas inserções encontradas

Todas estas seqüências suposta integradas foram analisadas para identificar todas as inserções L1 específicas para pilhas humanas, medido pelo menos por um chumbo do Ontário alinhado a um locus original. Não uma única inserção foi detectada dos genomas de SARS-CoV-2, de HCV ou de HBV.

Contudo, o programa identificou 575 inserções L1 com o TSDs flanqueando. Seventy-eight eram original às pilhas de SARS-CoV-2-infected ou aos controles zombaria-contaminados, maioria medida por um único lidas.

Entre estas inserções demedida, seis, que foram escolhidos aleatoriamente para a verificação e a confirmação do manual por um teste da reacção em cadeia (PCR) da polimerase, foram confirmados para mostrar todas as três características de uma inserção L1 verdadeira.

Em segundo lugar, os pesquisadores encontraram que o programa poderia recuperar uma única seqüência integrada HBV.

Contudo, não mostrou que a presença de todo o Ontário lê que poderia alinhar aos genomas de SARS-CoV-2 ou de HCV, mostrando que os retrotransposons e as inserções dos vírus exógenos estão distinguidos confiantemente.

Isto foi seguido pela descoberta que os dados do Ontário do primeiro estudo contiveram 555 lêem que poderiam ser alinhados ao genoma SARS-CoV-2. Um destes lê era a seqüência integrada putativo no cromossoma de X que não teve um 3' intervalo do polyA.

O comprimento médio destes lê era demasiado curto, contudo, comparado ao conjunto de dados total. Sobre a metade destes lê foram compor SARS-CoV-2 da seqüência, seqüências relativas a da elevada percentagem um L1 nos lê que foram alinhados a L1.

O programa não chamou integrants supostos do genoma SARS-CoV-2. Assim, apesar da presença de lê que poderia ser alinhada ao genoma viral no conjunto de dados do estudo mais adiantado, estes lê eram demasiado curto comparado ao típico lida. Assim, os pesquisadores postulam que estes poderiam ser produtos manufacturados moleculars interpretados errada como seqüências integradas SARS-CoV-2.

Estes resultados apontam à capacidade do único Ontário de medida lêem para detectar retrotransposons e para mostrar as inserções L1 endógenas nesta linha celular que faltou L1 overexpressed.

Que é a conclusão?

Na soma, nós não observamos a integração genomic de L1-mediated SARS-CoV-2 em pilhas de HEK293T, apesar da disponibilidade da maquinaria L1.”

A razão é que o L1 prefere claramente inverter transcreve seu próprio mRNA um pouco do que SARS-CoV-2. Assim, embora possível, este é provavelmente um fenômeno raro, como com outro poli-UM-rolamento RNAs celular.

Esse nós encontramos nenhuma evidência da integração SARS-CoV-2 sugere que tais eventos fossem in vivo altamente pouco susceptíveis de conduzir uma oncogénese mais atrasada ou explicar a detecção da cargo-recuperação do vírus.”

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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