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La secuencia de Nanopore contradice la integración del genoma humano de SARS-CoV-2

El coronavirus 2 (SARS-CoV-2), el agente causativo de la neumonía asiática del pandémico en curso de la enfermedad 2019 del coronavirus (COVID-19), es un virus con un genoma del ácido ribonucleico (ARN).

Recientemente, Zhang y otros propuso coronavirus de la neumonía asiática 2 secuestros (SARS-CoV-2) la maquinaria (L1) del retrotransposition LINE-1 para integrar en la DNA de células infectadas.

Ahora un nuevo trabajo de investigación de la prueba preliminar asentado al servidor del bioRxiv* despide la posibilidad, mencionada por ese estudio, que el virus inserta su material genético en el genoma de la célula huesped.

Fondo

Este virus falta una enzima reversa del transcriptase, que se requiere para convertir el ARN en su cabo complementario del ácido desoxirribonucléico (DNA). Por lo tanto, SARS-CoV-2 no incorpora su material genético en la DNA genomic humana durante su ciclo vital de la infección.

Ésta es una suposición crucial que es la base de las técnicas diagnósticas actuales usadas para esta infección y para sus consecuencias a largo plazo potenciales. Hay otros virus, tales como el virus de inmunodeficiencia humana 1 (HIV-1) y virus de la hepatitis B (HBV), que integran con la DNA y causan la transformación cacerígena o la infección crónica.

Todas las células mamíferas tienen retrotransposones (L1) LINE-1 en sus genomas. Esto da lugar al ARN de mensajero (mRNA) que codifica dos proteínas requeridas para el movimiento de L1. Éstos se representan como ORF1p y ORF2p.

El ORF2p actúa como un endonuclease así como transcriptase reverso (RT), con una tendencia fuerte de catalizar la transcripción reversa del L1 mRNA. Puede también movilizar el ARN celular, que lleva una cola polyadenylated, incluyendo el ARN de otros retrotransposones y de los genes que codifican las proteínas.

La última actividad es infrecuente, sin embargo, probablemente porque es suprimida por la célula. De hecho, menos que una única inserción celular del ARN debe ocurrir por 2.000 inserciones L1.

Ambos tipos de inserciones son marcados por duplicaciones del sitio del objetivo (TSDs) y una región de polyA de 3 ′, ocurriendo en L1 el ′ de la serie 5 - TTTT/AA. Estos signos ayudan a determinar inserciones verdaderas.

Pruebas anteriores

Anterior, las células de SARS-CoV-2-infected con L1 overexpressed fueron mostradas para contener la DNA idéntica al ARN viral. Esto fue acoplada con otras pruebas más débiles para probar la integración del ARN SARS-CoV-2 en el genoma de la célula huesped.

Esto fue seguida por la identificación de 63 series supuestas integradas de SARS-CoV-2 por el mismo investigador, usando una técnica de secuencia llamada secuencia de la largo-lectura de las tecnologías (ONT) de Oxford Nanopore. Solamente uno de éstos fue atravesado por un Ontario leído, en el cromosoma X, que mostraron TSDs potencial por ambas partes, y éste faltó el trecho previsto del polyA de 3 ′.

Por otra parte, una supresión de 28 kb parecía haber ocurrido de la serie viral. Los exones eran 26 el doblez enriquecido en estos integrants, el encontrar que no se puede explicar por la preferencia de la enzima L1.

El segundo estudio fue seguido por inmóvil otro, usando la secuencia de la corto-lectura de Illumina. Esto fue demandada para mostrar a uniones supuestas donde las series SARS-CoV-2 fueron ensambladas al genoma del ordenador principal en las células que faltaban niveles de L1.

Otras interpretaciones

Sin embargo, lee no atravesó la serie integrada. Una vez más la preparación de una biblioteca para la secuencia de Illumina se sabe para tender hacia la generación del artefacto. Estos hechos dejan la conclusión en duda.

Anterior, sin embargo, los científicos responsables del Ontario usado prueba preliminar actual leen para descubrir la transcripción reversa de L1-dependent de genomas virales. Un ejemplo es la incorporación de dos series del virus de la hepatitis (HCV) C en una muestra del tumor del hígado.

Por otra parte, la plataforma de la célula usada para el Ontario que ordena, a saber, las células de HEK293T, tiene muchas características que puedan hacerlo fácil fijar el acontecimiento de tales series virales reverso-transcritas. Por ejemplo, estas células expresan el L1 ORF1p, se han utilizado para validar los retrotransposones insertados L1, y sirven soportar la infección productiva SARS-CoV-2.

Objetivo del estudio

Usando el Ontario que ordenaba, el estudio actual tentativa analizar la DNA genomic de esta variedad de células después de infectarlas con SARS-CoV-2 en las dosis múltiples. Las células del mando eran el tumor y las variedades de células del no-tumor de un positivo del tumor del hígado para el virus de la hepatitis B.

El Ontario que ordenaba datos de los estudios anteriores fue agregado. Como mandos negativos, las células HCV-positivas previamente determinadas del carcinoma del hígado fueron utilizadas, junto con las células de hígado normales.

Detección del retrotransposition endógeno de L1-mediated en células humanas. a, diseño experimental. Las células de HEK- 293T fueron divididas en dos poblaciones (cultivares), que eran entonces cualquier SARS-CoV-2 infectados o falsas infectadas. La DNA fue extraída de cada cultivar, así como de muestras pacientes del carcinoma hepatocelular, y sujetada a la secuencia del Ontario. El Ontario lee fue utilizado para llamar la no-referencia L1 e inserciones del virus con TLDR, que también resuelve TSDs y otros sellos del retrotransposition. TSDs: triángulos rojos; trecho del polyA: rectángulo verde; Ontario leído: rectángulo azul. Nota: algunos ejemplos se adaptan de Ewing y de al.23 b, distribución dimensional del TSD para las inserciones de la no-referencia L1, según lo anotado por TLDR. c, en cuanto a b, excepto mostrar los datos para las inserciones L1 encontradas solamente en nuestras células de HEK293T infectadas con SARS-CoV-2 o nuestra mofa infectó las células. d, caracterización detallada de una inserción L1 descubierta en células infectadas SARS-CoV-2 de HEK293T por un único Ontario que atravesaba leyó alineado con el cromosoma 14. Los nucleótidos destacaron en rojo corresponden al sitio TSD de la integración. Los nucleótidos subrayados corresponden al adorno del EN L1. La historieta indica una inserción integral de L1HS flanqueada por TSDs (triángulos rojos), y un trecho del polyA 3ʹ (verde). Los números representan posiciones en relación con la serie L1.346 de L1HS. El Ontario que atraviesa relevante leído, con el identificador, se coloca por debajo la historieta. Los símbolos (α, β, δ, γ) representan la posición aproximada de las pinturas de fondo usadas para el sitio vacío/llenado y las reacciones de la validación de la polimerización en cadena de la unión de L1-genome. Las imágenes del gel visualizan los resultados de estos PCRs. Las tallas de la banda de la escalera están según lo indicado, NTC; mando del no-patrón. Los triángulos rojos indican la talla prevista de los amplicons L1 (triángulo vacío: ningún producto observado; triángulo llenado: producto observado). Los triángulos azules indican tallas vacías previstas del sitio. e, en cuanto a d, a excepción de un 5ʹ invertido/suprimió L1HS situado en el cromosoma 18.
Detección del retrotransposition endógeno de L1-mediated en células humanas. a, diseño experimental. Las células de HEK- 293T fueron divididas en dos poblaciones (cultivares), que eran entonces cualquier SARS-CoV-2 infectados o falsas infectadas. La DNA fue extraída de cada cultivar, así como de muestras pacientes del carcinoma hepatocelular, y sujetada a la secuencia del Ontario. El Ontario lee fue utilizado para llamar la no-referencia L1 e inserciones del virus con TLDR, que también resuelve TSDs y otros sellos del retrotransposition. TSDs: triángulos rojos; trecho del polyA: rectángulo verde; Ontario leído: rectángulo azul. Nota: algunos ejemplos se adaptan de Ewing y de al.23 b, distribución dimensional del TSD para las inserciones de la no-referencia L1, según lo anotado por TLDR. c, en cuanto a b, excepto mostrar los datos para las inserciones L1 encontradas solamente en nuestras células de HEK293T infectadas con SARS-CoV-2 o nuestra mofa infectó las células. d, caracterización detallada de una inserción L1 descubierta en células infectadas SARS-CoV-2 de HEK293T por un único Ontario que atravesaba leyó alineado con el cromosoma 14. Los nucleótidos destacaron en rojo corresponden al sitio TSD de la integración. Los nucleótidos subrayados corresponden al adorno del EN L1. La historieta indica una inserción integral de L1HS flanqueada por TSDs (triángulos rojos), y un trecho del polyA 3ʹ (verde). Los números representan posiciones en relación con la serie L1.346 de L1HS. El Ontario que atraviesa relevante leído, con el identificador, se coloca por debajo la historieta. Los símbolos (α, β, δ, γ) representan la posición aproximada de las pinturas de fondo usadas para el sitio vacío/llenado y las reacciones de la validación de la polimerización en cadena de la unión de L1-genome. Las imágenes del gel visualizan los resultados de estos PCRs. Las tallas de la banda de la escalera están según lo indicado, NTC; mando del no-patrón. Los triángulos rojos indican la talla prevista de los amplicons L1 (triángulo vacío: ningún producto observado; triángulo llenado: producto observado). Los triángulos azules indican tallas vacías previstas del sitio. e, en cuanto a d, a excepción de un 5ʹ invertido/suprimió L1HS situado en el cromosoma 18.

Ningunas inserciones encontradas

Todas estas series supuesto integradas eran analizadas para determinar todas las inserciones L1 específicas para las células humanas, atravesado por por lo menos un guía del Ontario alineado con un lugar geométrico único. No una única inserción fue descubierta de los genomas de SARS-CoV-2, de HCV o de HBV.

Sin embargo, el programa determinó 575 inserciones L1 con el TSDs que flanqueaba. Setenta y ocho era único a las células o a los mandos mofa-infectados, la mayoría de SARS-CoV-2-infected atravesada por un único leídos.

Entre estas inserciones único-que atravesaban, seis, que fueron elegidos al azar para la verificación y la confirmación del manual por una prueba de la reacción en cadena (PCR) de polimerasa, fueron confirmados para mostrar las tres características de una inserción verdadera L1.

En segundo lugar, los investigadores encontraron que el programa podría recuperar una única serie integrada HBV.

Sin embargo, no mostró que la presencia de cualquier Ontario lee que podría alinear con los genomas de SARS-CoV-2 o de HCV, mostrando que los retrotransposones y las inserciones de virus exógenos están distinguidos seguro.

Esto fue seguida por el descubrimiento que los datos del Ontario del primer estudio contuvieron 555 leen que se podrían alinear con el genoma SARS-CoV-2. Uno de éstos lee era la serie integrada supuesta en el cromosoma X que no tenía un 3' trecho del polyA.

El largo medio de éstos lee era demasiado corto, sin embargo, comparado al grupo de datos total. Sobre la mitad de éstos lee fueron compuestos SARS-CoV-2 de la serie, series en relación con de la parte elevada un L1 en lee que fueron alineados con L1.

El programa no pudo llamar integrants supuestos del genoma SARS-CoV-2. Así, a pesar de la presencia de lee que se podría alinear con el genoma viral en el grupo de datos del estudio anterior, éstos lee eran demasiado corto comparado al típico leída. Así, los investigadores postulan que éstos podrían ser artefactos moleculares interpretados incorrecto como series integradas SARS-CoV-2.

Estos resultados apuntan a la capacidad del único Ontario que atraviesa leen para descubrir retrotransposones y para mostrar las inserciones endógenas L1 en esta variedad de células que faltó L1 overexpressed.

¿Cuál es la conclusión?

En suma, no observamos la integración genomic de L1-mediated SARS-CoV-2 en células de HEK293T, a pesar de la disponibilidad de la maquinaria L1.”

La razón es que el L1 prefiere sin obstrucción invertir transcribe su propio mRNA bastante que SARS-CoV-2. Así, aunque sea posible, esto es probablemente un fenómeno raro, como con otro polivinílico-UNO-cojinete RNAs celular.

Ese encontramos ningunas pruebas de la integración SARS-CoV-2 sugieren que tales acciones in vivo sean muy poco probable impulsar oncogénesis posterior o explicar la detección de la poste-recuperación del virus.”

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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