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Deux médicaments repurposed empêchent des facteurs de l'entrée SARS-CoV-2 d'une façon synergique

La recherche du coffre-fort et des traitements efficaces pour contrer le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère a été allumée depuis que la première onde a montré les effets dévastateurs du virus sur une minorité significative de ceux infectés.

Un papier de prétirage téléchargé au serveur de bioRxiv* montre comment la combinaison des médicaments visant différents facteurs d'entrée de la cellule hôte peut éviter l'infection par le virus.

Doubles objectifs de protéase

Le virus SARS-CoV-2 engage sa cellule hôte par l'intermédiaire de plusieurs différentes voies. Le plus connu concerne l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2), le récepteur sur la cellule hôte, à laquelle la protéine virale de pointe se fixe. Ceci déclenche une modification conformationnelle massive qui fait protéger par fusible la membrane virale avec la cellule hôte.

Cette fusion facilite l'entrée virale dans le cytoplasme de cellule hôte par l'intermédiaire du trafic endosomal. Cependant, pour que la protéine de pointe fasse ceci, elle doit s'amorcer par une enzyme de protéase d'hôte, telle que TMPRSS2, ou par des cathepsins, au cours du processus de l'endocytose.

La cathepsine est en grande partie localisée vers la fin des endosomes ou des lysosomes, avec l'activité optimale à un pH acide, qui a mené au postulat que l'entrée virale est par l'intermédiaire du compartiment endolysosomal. Réciproquement, TMPRSS2 est une enzyme et des fonctionnements de surface de cellules sur une gamme des niveaux de pH, indiquant qu'il fend la protéine de pointe sur des particules virales à la membrane de plasma, facilitant l'entrée virale.

Tôt dans la pandémie, on l'a découvert que l'inhibiteur E-64 de cathepsine et le mesylate de camostat de l'inhibiteur TMPRSS2 ont bloqué l'infection SARS-CoV-2. Cependant, leur affinité obligatoire inférieure pour les protéases les a rendues inadmissibles pour des tests cliniques.

Un autre TMPRSS2 inhibiteur, mesylate de nafamostat, a une affinité nanomolar élevée pour l'enzyme.

Apilimod empêche les endosomes tardifs

En attendant, un apilimod appelé de médicament a été montré pour empêcher une autre enzyme impliquée dans le trafic endosomal, évitant l'entrée virale, bien que son mécanisme d'action ne soit pas clair.

Cette enzyme, kinase appelée de PIKfyve, est exigée pour produire d'une molécule contenant des phosphates principale qui règle beaucoup de protéines participant au trafic viral endosomal tardif. L'inhibition de cette enzyme mène à la prévention de l'infection avec Ebola, Marbourg, et SARS-CoV-2, comme a été expliqué dans des études plus tôt.

La kinase de PIKfyve peut régler des niveaux de cathepsine dans l'endosome parce que toutes les cellules en lesquelles E-64 a empêché l'entrée virale en bloquant l'amorçage cathepsine-assisté de la pointe étaient également sensibles à l'apilimod d'inhibiteur de kinase de PIKfyve, alors que ceux qui étaient résistants au premier également ne montraient pas l'inhibition avec la deuxième.

Combinaison synergique des inhibiteurs

L'infection SARS-CoV-2 est assistée par deux voies de protéase qui se complètent, une selon la cathepsine et l'autre sur TMPRSS2 pour amorcer la protéine de pointe pour la fusion. Les lignées cellulaires qui ont exprimé TMPRSS2 mais n'ont pas répondu à l'inhibition de cathepsine étaient complet sensibles aux inhibiteurs TMPRSS2.

L'étude actuelle a examiné différentes cellules avec des niveaux de variation de ces protéases, utilisant différentes combinaisons des inhibiteurs de la protéase avec l'apilimod, pour évaluer comment chacune a empêché un pseudovirus exprimant la protéine de la pointe SARS-CoV-2.

Les inhibiteurs de la protéase E-64, l
Les inhibiteurs de la protéase E-64, l'apilimod, le mesylate de camostat ou le mesylate de nafamostat évitent l'infection par VSV-SARS-CoV-2 mais pas par VSV. (a) Schéma d'analyse de pouvoir infectant pour des cellules traitées préalablement pour 1 h ou pas avec les inhibiteurs, par la suite infecté avec VSV-SARS-CoV-2 pour 1 h en la présence ou l'absence des inhibiteurs. Les cellules ont été incubées pour encore 7 h en la présence ou l'absence des inhibiteurs et puis fixées ; le pourcentage des cellules exprimant l'eGFP a mesuré par microscopie confocale de rotation de disque. (FB) La quantification du nombre de cellules infectées de trois expériences indépendantes, chacune déterminées à partir de 5 champs de vision contenant 80-200 cellules selon l'expérience (les barres d'erreur montrent le SEM) pour la cellule indiquée tape. Vero infecté (b) ou Vero + TMPRSS2 cellules C) étaient le hpi 8 analysé utilisant 0,5 ARNs de µg/mL VSV-SARS-CoV-2. Caco-2 (d) ou Calu-3 les cellules infectées (e) étaient le hpi 8 analysé utilisant 5 ARNs de µg/mL VSV-SARS-CoV-2. Les cellules infectées avec 0,075 ARNs de µg/mL VSV (f) étaient le hpi 6 analysé. Dans chaque cas, ces concentrations en virus et états de l'infection ont correspondu à un MOI du ~ 0,5.

Aux concentrations utilisées, on n'a pas observé la cytotoxicité.

Des combinaisons des inhibiteurs de la protéase avec l'apilimod se sont avérées pour montrer une augmentation saisissante de l'efficacité de l'inhibition, indiquant le synergisme plutôt que des synergies additives simples.

L'utilisation du mesylate d'apilimod et de camostat réduit la concentration 50% efficace (EC50) de ce dernier doubles contre SARS-CoV-2, alors qu'en cellules manquant de la cathepsine, l'EC50 diminuait quintuple. Une combinaison du mesylate d'apilimod et de nafamostat réduit le fois EC50 20.

Avec des concentrations plus élevées de mesylate de nafamostat, la combinaison a mené à une réduction de dix fois de l'EC50 de l'apilimod. La combinaison était également synergique contre des pseudoviruses exprimant la variante de pointe de D614G, qui est connue pour être plus contagieuse.

Ce synergisme intense a été provoqué par l'inhibition de TMPRSS2 et de la kinase endosomal de PIKfyve d'enzymes, par le mesylate de nafamostat et l'apilimod, respectivement, les deux aux concentrations nanomolar.

Un virus de contrôle qui n'exige pas l'un de ces enzymes pour l'entrée pouvait infecter ces lignées cellulaires, comme prévu.

La combinaison des inhibiteurs de ces deux enzymes a également évité l'infection SARS-CoV-2, avec le synergisme également intense.

Quelles sont les implications ?

Apilimod bloque la circulation virale endosomal tardive et empêche également l'entrée virale cathepsine-assistée dans les cellules par l'intermédiaire des endosomes tardifs. Les inhibiteurs TMPRSS2 évitent le viral infection de TMPRSS2-mediated.

La combinaison de ces inhibiteurs, agissant contre deux facteurs viraux différents d'entrée, a produit de l'activité synergique forte contre l'entrée SARS-CoV-2 dans des cellules hôte d'objectif, comparées à l'utilisation de l'un ou l'autre en isolation. Ce contraste avec les synergies additives vues avec l'utilisation combinée des inhibiteurs de cathepsine avec les inhibiteurs TMPRSS2 de bloquer l'infection par SARS-CoV-2.

Une telle inhibition était présente contre un pseudovirus exprimant la protéine de la pointe SARS-CoV-2 et SARS-CoV-2 le virus lui-même.

Les versions modifiées de ces inhibiteurs avec la biodisponibilité orale accrue subissent actuel des tests cliniques, seul étant employé pour traiter des conditions variées, y compris COVID-19. Des formulations intraveineuses du mesylate de nafamostat, avec une solubilité plus grande, sont vérifiées pour le traitement COVID-19.

Il est prétendu, basé sur le synergisme observé dans cette étude, que l'emploi de PIKfyve et d'inhibiteurs TMPRSS2 en association pourrait augmenter le rendement de l'inhibition virale par 5-10-fold dans les cellules hôte, marquant une avance dans la demande de règlement COVID-19.

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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