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Due droghe repurposed inibiscono i fattori dell'entrata SARS-CoV-2 in un modo sinergico

La ricerca delle droghe sicure ed efficaci di ricambiare il coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo è stata sopra da quando la prima onda ha mostrato gli effetti devastatori del virus su una minoranza significativa di quelli infettata.

Un documento della pubblicazione preliminare caricato al " server " del bioRxiv* mostra come combinare le droghe che mirano ai fattori differenti dell'entrata della cellula ospite può impedire l'infezione dal virus.

Obiettivi doppi della proteasi

Il virus SARS-CoV-2 impegna la sua cellula ospite via varie vie. Il più noto comprende l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2), il ricevitore sulla cellula ospite, a cui la proteina virale della punta si fissa. Ciò avvia un cambiamento conformazionale massiccio che induce la membrana virale a fondere con la cellula ospite.

Questa fusione facilita l'entrata virale nel citoplasma della cellula ospite via il traffico endosomal. Tuttavia, affinchè la proteina della punta faccia questo, deve essere innescata da un enzima della proteasi ospite, quale TMPRSS2, o dai cathepsins, nella fase del endocytosis.

La catepsina principalmente è localizzata verso la fine dei endosomes o dei lisosomi, con attività ottimale ad un pH acido, che piombo al postulato che l'entrata virale è via il compartimento endolysosomal. Per contro, TMPRSS2 è un enzima e funzioni della superficie delle cellule sopra un intervallo dei livelli di pH, indicante che fende la proteina della punta sulle particelle virali alla membrana di plasma, facilitante l'entrata virale.

Presto nella pandemia, è stato scoperto che l'inibitore E-64 della catepsina e il mesylate del camostat dell'inibitore TMPRSS2 hanno bloccato l'infezione SARS-CoV-2. Tuttavia, la loro affinità obbligatoria bassa per le proteasi le ha rese ineleggibili per i test clinici.

Un altro TMPRSS2 inibitore, mesylate del nafamostat, ha un'alta affinità nanomolar per l'enzima.

Apilimod inibisce i endosomes recenti

Nel frattempo, una droga chiamata apilimod è stata indicata per inibire un altro enzima in questione nel traffico endosomal, impedente l'entrata virale, sebbene il suo meccanismo di atto non fosse chiaro.

Questo enzima, chiamato chinasi di PIKfyve, è richiesto per generare una molecola contenente fosfati chiave che regolamenta molte proteine che partecipano al traffico virale endosomal recente. L'inibizione di questo enzima piombo alla prevenzione dell'infezione con Ebola, Marburgo e SARS-CoV-2, come è stato dimostrato negli studi più iniziali.

La chinasi di PIKfyve può regolamentare i livelli della catepsina nel endosome perché tutte le celle in cui E-64 ha impedito l'entrata virale bloccando l'innesco catepsina-mediato della punta erano egualmente sensibili al apilimod dell'inibitore della chinasi di PIKfyve, mentre quelle che erano resistenti al primi egualmente non sono riuscito a mostrare l'inibizione con la seconda.

Combinazione sinergica di inibitori

L'infezione SARS-CoV-2 è mediata da due vie della proteasi che si complementano, una secondo catepsina e l'altra su TMPRSS2 per innescare la proteina della punta per fusione. Le linee cellulari che hanno espresso TMPRSS2 ma non hanno risposto ad inibizione della catepsina erano completamente sensibili agli inibitori TMPRSS2.

Lo studio corrente ha verificato le celle differenti con i livelli di variazione di queste proteasi, facendo uso delle combinazioni differenti di inibitori di proteasi con apilimod, per valutare come ciascuno ha inibito uno pseudovirus che esprime la proteina della punta SARS-CoV-2.

Gli inibitori di proteasi E-64, il apilimod, il mesylate del camostat o il mesylate del nafamostat impediscono l
Gli inibitori di proteasi E-64, il apilimod, il mesylate del camostat o il mesylate del nafamostat impediscono l'infezione da VSV-SARS-CoV-2 ma non da VSV. (A) Disegno schematico dell'analisi di infettività per le celle pretrattate per 1 h o non con gli inibitori, successivamente infettato con VSV-SARS-CoV-2 per 1 h in presenza o assenza di inibitori. Le celle sono state incubate per gli altri 7 h in presenza o assenza di inibitori e poi sono state fissate; la percentuale delle celle che esprimono il eGFP ha misurato da microscopia confocale di filatura del disco. (BF) La quantificazione del numero delle celle infettate da tre esperimenti indipendenti, ciascuna determinati a partire da 5 campi di visibilità che contengono 80-200 celle per esperimento (le barre di errore mostrano SEM) per la cella indicata digita. Vero infettato (B) o Vero + TMPRSS2 le celle C) erano hpi analizzato 8 facendo uso di 0,5 RNA di µg/mL VSV-SARS-CoV-2. Caco-2 infettato (D) o celle Calu-3 (E) era hpi analizzato 8 facendo uso 5 del RNA di µg/mL VSV-SARS-CoV-2. Celle infettate con 0,075 RNA di µg/mL VSV (F) era hpi analizzato 6. In ogni caso, questi concentrazioni nel virus e stati dell'infezione hanno corrisposto ad un MOI di ~ 0,5.

Alle concentrazioni usate, la citotossicità non è stata osservata.

Le combinazioni di inibitori di proteasi con apilimod sono state trovate per mostrare un aumento notevole nell'efficacia dell'inibizione, indicante il sinergismo piuttosto che gli effetti additivi semplici.

L'uso del mesylate del camostat e del apilimod ha diminuito la concentrazione efficace 50% (EC50) degli ultimi duplici contro SARS-CoV-2, mentre in celle che mancano della catepsina, il EC50 quintuplo in diminuzione. Una combinazione di mesylate del nafamostat e del apilimod ha diminuito la volta EC50 20.

Con le più alte concentrazioni di mesylate del nafamostat, la combinazione piombo ad una riduzione composta di dieci parti del EC50 di apilimod. La combinazione era ugualmente sinergica contro gli pseudoviruses che esprimono la variante della punta di D614G, che è conosciuta per essere più infettiva.

Questo forte sinergismo è stato causato tramite l'inibizione sia di TMPRSS2 che della chinasi endosomal di PIKfyve degli enzimi, dal mesylate del nafamostat e dal apilimod, rispettivamente, entrambi alle concentrazioni nanomolar.

Un virus di controllo che non richiede qualcuno di questi enzimi per l'entrata poteva infettare queste linee cellulari, come previsto.

La combinazione di inibitori di questi due enzimi egualmente ha impedito l'infezione SARS-CoV-2, con sinergismo ugualmente forte.

Che cosa sono le implicazioni?

Apilimod blocca il traffico virale endosomal recente ed egualmente impedisce l'entrata virale catepsina-mediata nelle celle via i endosomes recenti. Gli inibitori TMPRSS2 impediscono l'infezione virale di TMPRSS2-mediated.

La combinazione di questi inibitori, agente contro due fattori virali differenti dell'entrata, ha generato l'attività sinergica intensa contro l'entrata SARS-CoV-2 nelle cellule ospiti dell'obiettivo, confrontate all'uso dell'uno o l'altro in isolamento. Ciò è contrariamente agli effetti additivi veduti con l'uso combinato degli inibitori della catepsina con gli inibitori TMPRSS2 bloccare l'infezione da SARS-CoV-2.

Tale inibizione era presente contro sia uno pseudovirus che esprime la proteina della punta SARS-CoV-2 che SARS-CoV-2 il virus stesso.

Le versioni modificate di questi inibitori con la biodisponibilità orale aumentata corrente stanno subendo i test clinici, essendo usando da solo per trattare i vari termini, compreso COVID-19. Le formulazioni endovenose del mesylate del nafamostat, con la maggior solubilità, stanno provande a terapia COVID-19.

È presunta, in base al sinergismo osservato in questo studio, che usando PIKfyve e gli inibitori TMPRSS2 in associazione potrebbe aumentare il risparmio di temi di inibizione virale da 5-10-fold nelle cellule ospiti, tracciante un avanzamento nel trattamento COVID-19.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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