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Duas drogas repurposed inibem factores da entrada SARS-CoV-2 em uma maneira sinérgico

A busca para que as drogas seguras e eficazes opor o coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) estêve ligada depois que a primeira onda mostrou os efeitos devastadores do vírus em uma minoria significativa daqueles contaminada.

Um papel da pré-impressão transferido ficheiros pela rede ao server do bioRxiv* mostra como combinar as drogas que visam factores diferentes da entrada da pilha de anfitrião pode impedir a infecção pelo vírus.

Alvos duplos do protease

O vírus SARS-CoV-2 contrata sua pilha de anfitrião através de diversos caminhos diferentes. O mais conhecido envolve a enzima deconversão 2 (ACE2), o receptor na pilha de anfitrião, a que a proteína viral do ponto se anexa. Isto provoca uma mudança conformational maciça que faça com que a membrana viral funda com a pilha de anfitrião.

Esta fusão facilita a entrada viral no citoplasma da pilha de anfitrião através do tráfico endosomal. Contudo, para que a proteína do ponto faça isto, deve ser aprontada por uma enzima do protease do anfitrião, tal como TMPRSS2, ou por cathepsins, durante o processo de endocytosis.

A catepsina é localizada na maior parte no final dos endosomes ou dos lisosomas, com actividade óptima em um pH ácido, que conduza ao postulado que a entrada viral é através do compartimento endolysosomal. Inversamente, TMPRSS2 é uma enzima e funções da superfície da pilha sobre uma escala de níveis do pH, indicando que fende a proteína do ponto em partículas virais na membrana de plasma, facilitando a entrada viral.

Cedo na pandemia, descobriu-se que o inibidor E-64 da catepsina e o mesylate do camostat do inibidor TMPRSS2 obstruíram a infecção SARS-CoV-2. Contudo, sua baixa afinidade obrigatória para os proteases tornou-os inelegíveis para ensaios clínicos.

Um outro TMPRSS2 inibidor, mesylate do nafamostat, tem uma afinidade nanomolar alta para a enzima.

Apilimod inibe endosomes atrasados

Entrementes, uma droga chamada apilimod foi mostrada para inibir uma outra enzima envolvida no tráfico endosomal, impedindo a entrada viral, embora seu mecanismo da acção não é claro.

Esta enzima, chamada quinase de PIKfyve, é exigida para gerar uma molécula decontenção chave que regule muitas proteínas que participam no tráfico viral endosomal atrasado. A inibição desta enzima conduz à prevenção da infecção com Ebola, Marburg, e SARS-CoV-2, como foi demonstrado em uns estudos mais adiantados.

A quinase de PIKfyve pode regular níveis da catepsina no endosome porque todas as pilhas em que E-64 inibiu a entrada viral obstruindo a escorva catepsina-negociada do ponto eram igualmente sensíveis ao apilimod do inibidor da quinase de PIKfyve, quando aquelas que eram resistentes ao primeiros igualmente não mostraram a inibição com a segunda.

Combinação sinérgico de inibidores

A infecção SARS-CoV-2 é negociada por dois caminhos do protease que se complementam, um segundo a catepsina e o outro em TMPRSS2 para aprontar a proteína do ponto para a fusão. As linha celular que expressaram TMPRSS2 mas não responderam à inibição da catepsina eram completamente sensíveis aos inibidores TMPRSS2.

O estudo actual testou pilhas diferentes com níveis de variação destes proteases, usando combinações diferentes de inibidores de protease com o apilimod, para avaliar como cada um inibiu um pseudovirus que expressa a proteína do ponto SARS-CoV-2.

Os inibidores de Protease E-64, o apilimod, o mesylate do camostat ou o mesylate do nafamostat impedem a infecção por VSV-SARS-CoV-2 mas não por VSV. (a) Diagrama esquemático do ensaio da infectividade para as pilhas pretreated para 1 h ou não com os inibidores, contaminado subseqüentemente com o VSV-SARS-CoV-2 para 1 h na presença ou na ausência de inibidores. As pilhas foram incubadas para uns outros 7 h na presença ou na ausência de inibidores e fixadas então; a porcentagem das pilhas que expressam o eGFP mediu pela microscopia confocal de giro do disco. (FB) A quantificação do número de pilhas contaminadas de três experiências independentes, cada um determinadas de 5 campos de vista que contêm 80-200 pilhas pela experiência (as barras de erro mostram SEM) para a pilha indicada dactilografa. Vero contaminado (b) ou Vero + TMPRSS2 as pilhas C) eram o hpi 8 analisado usando 0,5 RNA de µg/mL VSV-SARS-CoV-2. Caco-2 (d) ou Calu-3 as pilhas contaminadas (e) eram o hpi 8 analisado usando 5 o RNA de µg/mL VSV-SARS-CoV-2. As pilhas contaminadas com 0,075 RNA de µg/mL VSV (f) eram o hpi 6 analisado. Em cada caso, estas concentrações do vírus e condições da infecção corresponderam a um MOI do ~ 0,5.
Os inibidores de Protease E-64, o apilimod, o mesylate do camostat ou o mesylate do nafamostat impedem a infecção por VSV-SARS-CoV-2 mas não por VSV. (a) Diagrama esquemático do ensaio da infectividade para as pilhas pretreated para 1 h ou não com os inibidores, contaminado subseqüentemente com o VSV-SARS-CoV-2 para 1 h na presença ou na ausência de inibidores. As pilhas foram incubadas para uns outros 7 h na presença ou na ausência de inibidores e fixadas então; a porcentagem das pilhas que expressam o eGFP mediu pela microscopia confocal de giro do disco. (FB) A quantificação do número de pilhas contaminadas de três experiências independentes, cada um determinadas de 5 campos de vista que contêm 80-200 pilhas pela experiência (as barras de erro mostram SEM) para a pilha indicada dactilografa. Vero contaminado (b) ou Vero + TMPRSS2 as pilhas C) eram o hpi 8 analisado usando 0,5 RNA de µg/mL VSV-SARS-CoV-2. Caco-2 (d) ou Calu-3 as pilhas contaminadas (e) eram o hpi 8 analisado usando 5 o RNA de µg/mL VSV-SARS-CoV-2. As pilhas contaminadas com 0,075 RNA de µg/mL VSV (f) eram o hpi 6 analisado. Em cada caso, estas concentrações do vírus e condições da infecção corresponderam a um MOI do ~ 0,5.

Nas concentrações usadas, a citotoxidade não foi observada.

As combinações de inibidores de protease com o apilimod foram encontradas para mostrar um aumento impressionante na eficácia da inibição, indicando o synergism um pouco do que efeitos aditivos simples.

O uso do mesylate do apilimod e do camostat reduziu a concentração 50% eficaz (EC50) dos últimos duplos contra SARS-CoV-2, quando nas pilhas que faltam a catepsina, o EC50 quíntuplo diminuído. Uma combinação de mesylate do apilimod e do nafamostat reduziu a dobra EC50 20.

Com concentrações mais altas de mesylate do nafamostat, a combinação conduziu a uma redução da dez-dobra no EC50 do apilimod. A combinação era ingualmente sinérgico contra os pseudoviruses que expressam a variação do ponto de D614G, que é sabida para ser mais infeccioso.

Este synergism forte foi causado pela inibição de TMPRSS2 e da quinase endosomal de PIKfyve da enzima, pelo mesylate do nafamostat e pelo apilimod, respectivamente, ambos em concentrações nanomolar.

Um vírus do controle que não exigisse qualqueras um enzimas para a entrada podia contaminar estas linha celular, como esperado.

A combinação de inibidores destas duas enzimas igualmente impediu a infecção SARS-CoV-2, com synergism ingualmente forte.

Que são as implicações?

Apilimod obstrui o tráfego viral endosomal atrasado e igualmente inibe a entrada viral catepsina-negociada nas pilhas através dos endosomes atrasados. Os inibidores TMPRSS2 impedem a infecção viral de TMPRSS2-mediated.

A combinação destes inibidores, actuando contra dois factores virais diferentes da entrada, gerou a actividade sinérgico intensa contra a entrada SARS-CoV-2 nas pilhas de anfitrião do alvo, comparadas ao uso de um ou outro dentro isolamento. Isto é em contraste com os efeitos aditivos vistos com o uso combinado de inibidores da catepsina com os inibidores TMPRSS2 obstruir a infecção por SARS-CoV-2.

Tal inibição estou presente contra um pseudovirus que expressa a proteína do ponto SARS-CoV-2 e SARS-CoV-2 o vírus próprio.

As versões alteradas destes inibidores com disponibilidade biológica oral aumentada estão submetendo-se actualmente a ensaios clínicos, sendo usado apenas para tratar as várias circunstâncias, incluindo COVID-19. As formulações intravenosas do mesylate do nafamostat, com maior solubilidade, estão sendo testadas para a terapia COVID-19.

É suposta, com base no synergism observado neste estudo, que usar PIKfyve e inibidores TMPRSS2 na combinação poderia aumentar a eficiência da inibição viral por 5-10-fold nas pilhas de anfitrião, marcando um avanço no tratamento COVID-19.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

Citations

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