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Dos drogas repurposed inhiben factores del asiento SARS-CoV-2 de una manera sinérgica

La búsqueda para que las drogas seguras y de manera efectiva contradigan el coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática ha estado prendido desde entonces la primera onda mostrara los efectos devastadores del virus sobre una minoría importante de ésos infectada.

Un papel de la prueba preliminar cargado por teletratamiento al servidor del bioRxiv* muestra cómo combinar las drogas que apuntan diversos factores del asiento de la célula huesped puede prevenir la infección por el virus.

Objetivos dobles de la proteasa

El virus SARS-CoV-2 dedica su célula huesped vía varios diversos caminos. El más conocido implica la enzima angiotensina-que convierte 2 (ACE2), el receptor en la célula huesped, a la cual la proteína viral del pico se sujeta. Esto acciona un cambio conformacional masivo que haga la membrana viral fundir con la célula huesped.

Esta fusión facilita el asiento viral en el citoplasma de la célula huesped vía el tráfico endosomal. Sin embargo, para que la proteína del pico haga esto, debe ser preparada por una enzima de la proteasa del ordenador principal, tal como TMPRSS2, o por los cathepsins, durante el proceso de endocytosis.

La catepsina se localiza sobre todo a finales de endosomes o de lisosomas, con actividad óptima en un pH ácido, que ha llevado al postulado que el asiento viral está vía la división endolysosomal. Inversamente, TMPRSS2 es una enzima y funciones de la superficie de la célula sobre un alcance de los niveles del pH, indicando que hiende la proteína del pico en partículas virales en la membrana de plasma, facilitando el asiento viral.

Temprano en el pandémico, fue descubierto que el inhibidor E-64 de la catepsina y el mesylate del camostat del inhibidor TMPRSS2 cegaron la infección SARS-CoV-2. Sin embargo, su afinidad obligatoria inferior para las proteasas las hizo inelegibles para las juicios clínicas.

Otro TMPRSS2 inhibidor, mesylate del nafamostat, tiene una alta afinidad nanomolar para la enzima.

Apilimod inhibe últimos endosomes

Mientras tanto, una droga llamada apilimod fue mostrada para inhibir otra enzima implicada en el tráfico endosomal, previniendo el asiento viral, aunque su mecanismo de la acción no está sin obstrucción.

Esta enzima, llamada cinasa de PIKfyve, se requiere para generar una molécula con fosfato dominante que regule muchas proteínas que participan en el último tráfico viral endosomal. La inhibición de esta enzima lleva a la prevención de la infección con Ebola, Marburgo, y SARS-CoV-2, como se ha demostrado en estudios anteriores.

La cinasa de PIKfyve puede regular niveles de la catepsina en el endosome porque todas las células en las cuales E-64 inhibió el asiento viral cegando el cebo catepsina-mediado del pico eran también sensibles al apilimod del inhibidor de la cinasa de PIKfyve, mientras que las que eran resistentes al primeros también no pudieron mostrar la inhibición con la segunda.

Combinación sinérgica de inhibidores

La infección SARS-CoV-2 es mediada por dos caminos de la proteasa que se complementen, uno dependiendo de catepsina y el otro en TMPRSS2 para preparar la proteína del pico para la fusión. Las variedades de células que expresaron TMPRSS2 pero no respondieron a la inhibición de la catepsina eran totalmente sensibles a los inhibidores TMPRSS2.

El estudio actual probó diversas células con los niveles de variación de estas proteasas, usando diversas combinaciones de los inhibidores de proteasa con el apilimod, para fijar cómo cada uno inhibió un pseudovirus que expresaba la proteína del pico SARS-CoV-2.

Los inhibidores de proteasa E-64, el apilimod, el mesylate del camostat o el mesylate del nafamostat previenen la infección por VSV-SARS-CoV-2 pero no por VSV. (a) Diagrama esquemático del análisis de la contagiosidad para las células pretratadas para 1 h o no con los inhibidores, infectado posteriormente con VSV-SARS-CoV-2 para 1 h en la presencia o la ausencia de inhibidores. Las células fueron incubadas para otros 7 h en la presencia o la ausencia de inhibidores y después reparadas; el porcentaje de las células que expresaban el eGFP midió por microscopia confocal de giro del disco. (FB) La cuantificación del número de células infectadas a partir de tres experimentos independientes, cada uno determinados a partir de 5 campos visuales que contienen 80-200 células por el experimento (las barras de desvío muestran SEM) para la célula indicada pulsa. Vero infectado (b) o Vero + TMPRSS2 las células C) eran el hpi analizado 8 usando 0,5 ARN de µg/mL VSV-SARS-CoV-2. Caco-2 (d) o Calu-3 las células infectadas (e) eran el hpi analizado 8 usando 5 el ARN de µg/mL VSV-SARS-CoV-2. Las células infectadas con 0,075 ARN de µg/mL VSV (f) eran el hpi analizado 6. En cada caso, estas concentraciones del virus y condiciones de la infección correspondieron a un MOI del ~ 0,5.
Los inhibidores de proteasa E-64, el apilimod, el mesylate del camostat o el mesylate del nafamostat previenen la infección por VSV-SARS-CoV-2 pero no por VSV. (a) Diagrama esquemático del análisis de la contagiosidad para las células pretratadas para 1 h o no con los inhibidores, infectado posteriormente con VSV-SARS-CoV-2 para 1 h en la presencia o la ausencia de inhibidores. Las células fueron incubadas para otros 7 h en la presencia o la ausencia de inhibidores y después reparadas; el porcentaje de las células que expresaban el eGFP midió por microscopia confocal de giro del disco. (FB) La cuantificación del número de células infectadas a partir de tres experimentos independientes, cada uno determinados a partir de 5 campos visuales que contienen 80-200 células por el experimento (las barras de desvío muestran SEM) para la célula indicada pulsa. Vero infectado (b) o Vero + TMPRSS2 las células C) eran el hpi analizado 8 usando 0,5 ARN de µg/mL VSV-SARS-CoV-2. Caco-2 (d) o Calu-3 las células infectadas (e) eran el hpi analizado 8 usando 5 el ARN de µg/mL VSV-SARS-CoV-2. Las células infectadas con 0,075 ARN de µg/mL VSV (f) eran el hpi analizado 6. En cada caso, estas concentraciones del virus y condiciones de la infección correspondieron a un MOI del ~ 0,5.

En las concentraciones usadas, la citotoxicidad no fue observada.

Las combinaciones de los inhibidores de proteasa con el apilimod fueron encontradas para mostrar un aumento llamativo en la eficacia de la inhibición, indicando sinergia bastante que efectos aditivos simples.

El uso del mesylate del apilimod y del camostat redujo la concentración el 50% efectiva (EC50) de estes último dobles contra SARS-CoV-2, mientras que en las células que faltaban catepsina, el EC50 quíntuplo disminuida. Una combinación del mesylate del apilimod y del nafamostat redujo el doblez EC50 20.

Con concentraciones más altas de mesylate del nafamostat, la combinación llevó a una reducción décupla en el EC50 del apilimod. La combinación era igualmente sinérgica contra los pseudoviruses que expresaban la variante del pico de D614G, que se sabe para ser más contagiosa.

Esta sinergia fuerte fue causada por la inhibición de TMPRSS2 y de la cinasa endosomal de PIKfyve de la enzima, por el mesylate del nafamostat y el apilimod, respectivamente, ambos en las concentraciones nanomolar.

Un virus del mando que no requiere ninguno de estos enzimas para el asiento podía infectar estas variedades de células, como se esperaba.

La combinación de los inhibidores de estas dos enzimas también previno la infección SARS-CoV-2, con sinergia igualmente fuerte.

¿Cuáles son las implicaciones?

Apilimod ciega último tráfico viral endosomal y también inhibe el asiento viral catepsina-mediado en las células vía últimos endosomes. Los inhibidores TMPRSS2 previenen la infección viral de TMPRSS2-mediated.

La combinación de estos inhibidores, actuando contra dos diversos factores virales del asiento, generó actividad sinérgica intensa contra el asiento SARS-CoV-2 en las células huesped de objetivo, comparadas al uso de cualquier hacia adentro aislamiento. Esto está en contraste con los efectos aditivos vistos con el uso combinado de los inhibidores de la catepsina con los inhibidores TMPRSS2 de cegar la infección por SARS-CoV-2.

Tal inhibición estaba presente contra un pseudovirus que expresaba la proteína del pico SARS-CoV-2 y SARS-CoV-2 el virus sí mismo.

Las versiones modificadas de estos inhibidores con biodisponibilidad oral creciente están experimentando actualmente juicios clínicas, siendo utilizado solamente para tratar diversas condiciones, incluyendo COVID-19. Las formulaciones intravenosas del mesylate del nafamostat, con mayor solubilidad, se están probando para la terapia COVID-19.

Es supuesta, sobre la base de la sinergia observada en este estudio, que usar PIKfyve y los inhibidores TMPRSS2 en la combinación podría aumentar la eficiencia de la inhibición viral en 5-10-fold en las células huesped, marcando un avance en el tratamiento COVID-19.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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