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I ricercatori del MIT sviluppano un'analisi molecolare per individuare i livelli sotto--picomolar del dominio dell'ricevitore-associazione di SARS-CoV-2

Un gruppo dei ricercatori al MIT ha sviluppato un'analisi molecolare per individuare i livelli sotto--picomolar del dominio dell'ricevitore-associazione della proteina della punta di SARS-CoV-2 (S-RBD) facendo uso dei gavitelli informaticamente convalidati del peptide in una rilevazione a passo singolo con la produzione di un segnale della fluorescenza. Il gruppo ha rilasciato i loro risultati sul " server " della pubblicazione preliminare del bioRxiv*.

I test diagnostici il più ampiamente impiegati per il coronavirus 2 (SARS-CoV-2), gli agenti causativi di sindrome respiratorio acuto severo della malattia 2019 (COVID-19) di coronavirus, sono i metodi basati di reazione a catena della trascrizione-polimerasi inversa (RT-PCR) - con i limiti di una rilevazione (LoD) 102 -103 di RNA copies/ml, che è RNA attomolar circa (aM) 1-10 nel volume della prova.

Studio: Rilevazione Sotto--Picomolar di SARS-CoV-2 RBD tramite gavitelli Di calcolo-Ottimizzati del peptide. Credito di immagine: Design_Cells/Shutterstock

Tuttavia, le prove di RT-PCR sono laboriose, richiedendo l'isolamento dell'acido nucleico, la depurazione e le fasi di lavorazione costosi. Ciò aumenta sia il tempo complessivo di rilevazione che il costo della prova. Mentre altre tecnologie basate su CRISPR e sull'amplificazione ciclo-mediata per i sistemi diagnostici esistono, i sistemi diagnostici rapidi di punto-de-cura per la rilevazione del SARS-CoV-2 possono accelerare la lotta per gestire gli scoppi dell'infezione.

In uno studio recente, i ricercatori da Massachusetts Institute of Technology (MIT) hanno costruito i gavitelli molecolari, facendo uso di struttura delle proteine d'apprendimento, che si illuminano alle concentrazioni sotto--picomolar altamente sensibili del SARS-CoV-2 RBD (dominio dell'ricevitore-associazione). Le funzioni del gavitello come opzione conformazionale: accende in presenza del RBD virale producendo un segnale della fluorescenza utilizzare un paio del fluorophore-quencher.

I gavitelli formano un heterodimer che contiene insieme due peptidi, con un legante obbligatorio fra loro per individuare la presenza di S-RBD.

In assenza di S-RBD (FUORI), i gavitelli del peptide adottano una conformazione chiusa che si apre una volta rilegata allo S-RBD ed il paio del fluorophore-quencher alle due estremità dei gambi del heterodimer produce un segnale della fluorescenza (SOPRA).

I ricercatori hanno dimostrato che due gavitelli del candidato, C17LC21 e C21LC21, possono individuare il RBD con i limiti di rilevazione (LoD) nell'intervallo sotto--picomolar.

Il nostro scopo finale è di integrare questi gavitelli ottimizzati all'interno dei microscopi di fluorescenza totali miniaturizzati del riflesso (TIRF) interno, che forniscono la sensibilità squisita dai fluorophores emozionanti presenti all'interno di prossimità di nanometro della superficie dell'unità, producendo gli alti rapporti di segnale--sfondo e permettendo alla tempestiva e rilevazione ultrasensibile di SARS-CoV-2,„ ha detto i ricercatori.

Qui, i ricercatori hanno usato il meccanismo del trasferimento di energia di risonanza di Forster (FRET), dove il risparmio di temi del trasferimento di energia fra il fluorophore ed il quencher è proporzionale alla loro distanza spaziale. La presenza o l'assenza dello S-RBD causa un piccolo cambio nella distanza spaziale fra le due armi del gavitello, drasticamente cambianti il risparmio di temi del CERCHIO.

Quindi, questo pregiudica il rendimento quantico fluorescente del fluorophore. L'aumento nel segnale della fluorescenza è proporzionale alla quantità del presente di S-RBD. I ricercatori hanno usato le paia comunemente usate del fluorophore-quencher: isotiocianato di fluorescina (FITC) e [(N, N-dimetilamminati) benzoile di phenylazo 4] (DABCYL), rispettivamente.

I ricercatori hanno selezionato informaticamente i candidati del gavitello del peptide (C13LC21, C17LC21 e C21L21) che hanno messo in bacino con successo gli S-RBD che separano le due armi del gavitello che alloggiano il fluorophore ed il quencher, accendente alla conformazione.

Dopo questa conferma, hanno verificato sperimentalmente queste progettazioni del gavitello di tre peptidi a capacità obbligatoria con S-RBD in cellule umane e a risposta di rilevazione in vitro. Hanno osservato che il C17LC21 ha mostrato il più alta sensibilità verso S-RBD con un LoD quasi 20 di fM (Kd = 1,615 × 10)−12, seguito da C21LC21 che ha un LoD 400 di fM (Kd = 6,766 × 10)−13.

Hanno concluso che il C17LC21 e il C21LC21 potrebbero individuare la presenza di S-RBD con la sensibilità sotto--picomolar e la reattività crociata bassa. Così motivando l'applicazione di questi gavitelli molecolari per tempestiva rilevazione di SARS-CoV-2.

Questo lavoro “montra un caso di uso per gli strumenti d'apprendimento profondi correnti per la previsione della struttura della proteina in una conduttura di struttura delle proteine,„ ha detto i ricercatori. Hanno dimostrato questo impiegando un approccio ibrido delle tecniche di modellizzazione avanzate della proteina per la progettazione molecolare del gavitello. Seguito con la convalida sperimentale robusta, questa progettazione molecolare del gavitello servisce da piattaforma potente combattere COVID-19 e le minacce virali emergenti di futuro.

I ricercatori scrivono:

In questo studio, facendo uso dell'esistenza strumenti in profondità d'apprendimento per la previsione della struttura della proteina ed alle le serie modellanti basate a energia, abbiamo progettato e collaudato un insieme dei gavitelli molecolari che possono potente legare allo S-RBD e rilasciano un segnale della fluorescenza via il CERCHIO, permettendo ai livelli sotto--picomolar di rilevazione.„

L'integrazione di questi gavitelli del peptide all'interno dei sensori ottici, quali i microscopi miniatura di TIRF, può ridurre il LoD al livello sotto--femtomolar, così rendendo una rapida, la piattaforma diagnostica di punto-de-cura per SARS-CoV-2, i ricercatori prevede.

avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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