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Os pesquisadores do MIT desenvolvem um ensaio molecular para detectar níveis secundários-picomolar do domínio receptor-obrigatório de SARS-CoV-2

Uma equipe dos pesquisadores no MIT desenvolveu um ensaio molecular para detectar níveis secundários-picomolar do domínio receptor-obrigatório da proteína do ponto de SARS-CoV-2 (S-RBD) que usa balizas computacionalmente validadas do peptide em uma detecção de uma etapa com a produção de um sinal da fluorescência. A equipe liberou seus resultados no server da pré-impressão do bioRxiv*.

Os testes de diagnóstico o mais extensamente empregados para o coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), os agentes causais da doença 2019 do coronavirus (COVID-19), são a reacção em cadeia reversa da transcrição-polimerase (RT-PCR) - métodos baseados - com limites de detecção (LoD) 102 -103 de RNA copies/ml, que é o RNA aproximadamente 1-10 (aM) attomolar no volume do teste.

Estudo: Detecção Secundária-Picomolar de SARS-CoV-2 RBD através das balizas Computacional-Aperfeiçoadas do Peptide. Crédito de imagem: Design_Cells/Shutterstock

Contudo, os testes de RT-PCR são laboriosos, exigindo o isolamento do ácido nucleico, a purificação, e etapas de processamento caros. Isto aumenta o tempo de resposta da detecção e o custo do teste. Quando outras tecnologias baseadas em CRISPR e na amplificação laço-negociada para diagnósticos existirem, os diagnósticos rápidos do ponto--cuidado para detectar SARS-CoV-2 podem acelerar a luta para controlar as manifestações da infecção.

Em um estudo recente, os pesquisadores de Massachusetts Institute of Technology (MIT) projectaram as balizas moleculars, usando-se profundo-aprendendo o projecto da proteína, que se iluminam acima em concentrações secundárias-picomolar altamente sensíveis do SARS-CoV-2 RBD (domínio receptor-obrigatório). As funções da baliza como um interruptor conformational: vai SOBRE na presença do RBD viral produzindo um sinal da fluorescência utilizar um par do fluoróforo-quencher.

As balizas formam um heterodimer que contem dois peptides junto, com uma ligante obrigatória entre eles para detectar a presença de S-RBD.

Na ausência de S-RBD (FORA), as balizas do peptide adotam uma conformação fechado que abra quando encadernada ao S-RBD, e o par do fluoróforo-quencher nas duas extremidades das hastes do heterodimer produza um sinal da fluorescência (SOBRE).

Os pesquisadores demonstraram que duas balizas do candidato, C17LC21 e C21LC21, podem detectar o RBD com limites de detecção (LoD) na escala secundária-picomolar.

Nosso objetivo eventual é integrar estas balizas aperfeiçoadas dentro dos microscópios de fluorescência totais miniaturizados da reflexão (TIRF) interna, que fornecem a sensibilidade excelente pelos fluorophores emocionantes actuais dentro da proximidade do nanômetro da superfície do dispositivo, produzindo relações altas do sinal-à-fundo e permitindo a detecção rápida e ultra-sensível de SARS-CoV-2,” disse os pesquisadores.

Aqui, os pesquisadores usaram o mecanismo de transferência de energia da ressonância de Forster (FRET), onde a eficiência de transferência de energia entre o fluoróforo e o quencher é proporcional a sua distância espacial. A presença ou a ausência do S-RBD causam uma pequena alteração na distância espacial entre os dois braços da baliza, mudando dràstica a eficiência da FRICÇÃO.

Assim, isto afecta o rendimento de quantum fluorescente do fluoróforo. O aumento no sinal da fluorescência é proporcional à quantidade do presente de S-RBD. Os pesquisadores usaram os pares de uso geral do fluoróforo-quencher: isothiocyanate de fluoresceína (FITC) e [(N, N-dimethylamino) benzoyl do phenylazo 4] (DABCYL), respectivamente.

Os pesquisadores seleccionaram computacionalmente os candidatos da baliza do peptide (C13LC21, C17LC21, e C21L21) que entraram com sucesso o S-RBD que separa os dois braços da baliza que abrigam o fluoróforo e o quencher, ligando à conformação.

Após esta confirmação, testaram experimental estes projectos da baliza de três peptide para capacidade obrigatória com o S-RBD em pilhas humanas e para a resposta da detecção in vitro. Observaram que o C17LC21 mostrou a sensibilidade a mais alta para S-RBD com um LoD do fM quase 20 (Kd = 1,615 × 10−12), seguido por C21LC21 que tem um LoD do fM 400 (Kd = 6,766 × 10−13).

Concluíram que o C17LC21 e o C21LC21 poderiam detectar a presença de S-RBD com sensibilidade secundária-picomolar e baixa reactividade cruzada. Assim motivando a aplicação destas balizas moleculars para a detecção rápida de SARS-CoV-2.

Este trabalho “apresenta um exemplo do uso para ferramentas de aprendizagem profundas actuais para a previsão da estrutura da proteína em um encanamento do projecto da proteína,” disse os pesquisadores. Demonstraram este empregando uma aproximação híbrida da proteína avançada que modela ferramentas para o projecto molecular da baliza. Seguido com a validação experimental robusta, este projecto molecular da baliza serve como uma plataforma poderosa para lutar COVID-19 e ameaças virais emergentes do futuro.

Os pesquisadores escrevem:

Neste estudo, usando a existência profundamente aprendendo ferramentas para a proteína estruture a previsão e energia-baseia modelando séries, nós projectamos e testamos um grupo de balizas moleculars que podem potently ligar ao S-RBD e liberam um sinal da fluorescência através da FRICÇÃO, permitindo níveis secundários-picomolar da detecção.”

A integração destas balizas do peptide dentro dos sensores ópticos, tais como microscópios diminutos de TIRF, pode reduzir o LoD ao nível secundário-femtomolar, assim rendendo um rapid, a plataforma diagnóstica do ponto--cuidado para SARS-CoV-2, os pesquisadores prevê.

observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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    Dwivedi, Ramya. (2021, June 08). Os pesquisadores do MIT desenvolvem um ensaio molecular para detectar níveis secundários-picomolar do domínio receptor-obrigatório de SARS-CoV-2. News-Medical. Retrieved on September 22, 2021 from https://www.news-medical.net/news/20210608/MIT-researchers-develop-a-molecular-assay-to-detect-sub-picomolar-levels-of-the-SARS-CoV-2s-receptor-binding-domain.aspx.

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