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Les variantes SARS-CoV-2 apparaissantes contiennent les mutations qui nuisent l'ordonnancement génomique

Pendant que le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère commençait sa marche mortelle en travers du monde fin 2019, commençant la pandémie de la maladie 2019 de coronavirus (COVID-19), l'endiguement viral a été l'orientation primaire avec la demande de règlement de la maladie symptomatique.

Le contrôle génomique a joué un rôle principal dans l'identification précoce des variantes apparaissantes de la préoccupation (VOCs) qui menacent de provoquer des réapparitions de l'infection dans les endroits avec un certain degré de contrôle. Ces VOCs contiennent les mutations qui peuvent permettre au virus d'échapper à la neutralisation par des anticorps à d'autres tensions ou d'éluder la réaction immunitaire. D'autres mutations peuvent augmenter le pouvoir infectant ou le transmissibility viral.

Ce travail dépend de la mise en commun des séquences d'entier-génome de partout dans le monde. Une étude récente des chercheurs au Canada montre comment les mutations dans des lignées apparaissantes neuf de SARS-CoV-2 peuvent perturber le procédé de ordonnancement et nuire ainsi ce domaine de recherche important. L'équipe a relâché leurs découvertes comme prétirage sur le serveur de medRxiv*.

Mouvement propre

L'ordonnancement génomique est basé sur l'utilisation du matériel génétique viral amplifié, ou de l'acide ribonucléique (ARN), des spécimens cliniques. L'amplification est nécessaire parce que les concentrations de l'ARN viral dans de tels échantillons sont très inférieures.

Le procédé type utilisé pour l'amplification est basé sur l'amplicon ordonnançant, utilisant des amplifications en chaîne par polymérase multiples (PCR) faites fonctionner en parallèle. Chacun utilise un ensemble différent d'amorces, ou de morceaux d'ARN, qui règlent hors du procédé de la synthèse d'ARN.

Chaque amorce doit gripper à sa région complémentaire sur l'ARN viral, plutôt comme les deux côtés d'une tirette maillant ensemble. Ils déclenchent alors la synthèse de l'ARN complémentaire de la boucle de matrice.

Les amorces sont utilisées dans les paires et décalées en travers du génome entier, espérant amplifier la boucle entière d'ARN du virus. Cependant, les mutations dans les tensions plus neuves peuvent déstabiliser l'obligation entre l'amorce et l'ARN de matrice, nuisant leur rendement.

Les lacunes donnantes droit dans la couverture de génome réduisent le nombre de génomes SARS-CoV-2 complets de haute qualité.

Qu'a stimulé cette recherche ?

Par exemple, la Colombie-Britannique centre pour les pièces manquantes trouvées publiques du laboratoire de la santé de la lutte contre la maladie (BCCDC PHL) en travers de trois amplicons qui ont couvert des parties du cadre ouvert de lecture viral (cadre de lecture ouvert) 1a et le gène de pointe dans leur ordonnancement des tensions locales de P.1 SARS-CoV-2 par le plan libéré d'amplicon.

Dans l'étude actuelle, de la Colombie-Britannique (BC), le Canada, les chercheurs a exploré les raisons, se concentrant sur le rendement de ce plan qui emploie des amplicons de 1.200 paires de bases (bp) pour ordonnancer le génome viral. Ils ont supposé que ces lacunes étaient dues à l'échec d'amorce à cause des mutations dans la variante P.1.

Ils ont analysé les séquences P.1 locales obtenues par le BCCDC PHL avant le 7 avril 2021, ainsi que ceux ont téléchargé SARS-CoV-2 à la base de données mondiale GISAID appelé (initiative globale pour partager toutes les caractéristiques de grippe). Ils ont constaté que plus de 98% des séquences a montré trois variantes au site d'amorce.

Intéressant, les variantes d'amorce étaient dans les mêmes amplicons qui n'ont pas amplifié avec le plan libéré d'amorce. C'étaient l'amplicon 21, 24 et 25.

Les variantes d'amorce produisent des mésappariements avec de l'ARN de matrice

Dans le premier, l'amplicon 21, deux mésappariements ont été trouvés entre l'amorce et l'ARN variable, une au 3' l'extrémité, qui est importante pour la synthèse d'ARN. Comme résultat, cet amplicon a été affecté le plus sévèrement en termes de profondeur de couverture ou le numéro de s'affiche.

Les deux autres amplicons ont contenu les mésappariements uniques avec les amorces, mais les deux étaient plus proches le 5' extrémité de la boucle d'ARN. Cette observation élimine l'interférence évidente avec la synthèse d'ARN qui est vue avec le mésappariement de l'amplicon 21, signifiant que d'autres explications, seule position de fonctionnement non basée, doivent être recherchées des observations empiriques.

Remise de la complémentarité

Les chercheurs ont conçu des amorces pour compléter les amorces libérées, les basant sur les variantes qu'ils avaient trouvées pendant leur analyse. Ceux-ci ont été alors ajoutés aux gisements libérés d'amorce à la même concentration molaire, qu'amélioré la profondeur moyenne de la couverture pour l'amplicon 21 et 25 aux niveaux a réalisée avec la lignée non-P.1.

La profondeur de couverture d'Amplicon 25 s'est améliorée, cependant jusqu'à un en quelque sorte peu de degré, quand le mélange a été cloué avec une concentration molaire quatre fois plus élevée de l'amorce neuve.

Ces résultats ont été appariés aux mêmes spécimens ordonnancés par le gisement libéré non-pointu d'amorce pour s'assurer que pointe-dans des amorces a permis à d'autres amplicons d'être ordonnancé avec la même profondeur de la couverture. Le même était vrai des lignées non-P.1.

Mutations répandues d'amorce

Les chercheurs ont alors exploré l'effet des mutations dans tout autre VOCs actuel de diffusion, y compris B.1.1.7, B.1.351, P.1, et B.1.617, utilisant le gisement libéré d'amorce et le gisement ARTIC de l'amorce (v.3). Ils ont découvert que les deux plans montrés ont nui le rendement dû à aucune moins de 46 variantes aux sites d'amorce.

De ces derniers, de 34 affectés l'ARTIC, et de 12 le protocole libéré. L'effet plus grand sur l'ancien est probablement parce qu'il emploie de plus petits amplicons, qui signifie que plus d'amorces sont combinaison nécessaire pour amplifier le génome entier. C'est des perturbations mutation-induites plus enclines de l'ordonnancement.

De plus longs amplicons réduisent l'effet de différentes mutations de site d'amorce, mais si on est affecté, une plus grande extension du génome est affectée. Ainsi, le pour - et - le contre d'un plan d'amorce doit être maintenu dans l'esprit en amplifiant des morceaux d'ARN viral.

Il y avait cinq variantes affectant l'ordonnancement de la lignée B.1.1.7, neuf pour le COV B.1.351, alors que B.1.617+ et les lignées P.1 montraient 16 variantes d'amorce. Plusieurs de ces variantes ont dominé leur lignée, comme montré par le fait qui avec 12 d'entre eux, 90% des isolats ordonnancés pour cette lignée a contenu la variante d'intérêt.

Quelles sont les implications ?

L'étude montre la nature essentielle des effets produits par des mutations au site d'amorce pendant un protocole d'amplification. Ceci signifie que des lignées plus neuves doivent être suivies pour recenser de telles mutations.

En tant qu'élément de ce procédé, les effets réels des variantes d'amorce doivent être validés sur la base des caractéristiques de laboratoire.

En employant un programme déjà procurable de bio-informatique, les chercheurs pouvaient découvrir la présence de trois mutations qui sont présentes dans une proportion considérable de la lignée P.1. Ils pouvaient également rectifier partiellement les lacunes dans la profondeur de la couverture de séquence en clouant dans des amorces de créateur.

Utilisant le même programme de PCR_strainer, ils ont également trouvé un grand nombre de variantes d'amorce qui perturbent ces protocoles de ordonnancement utilisés généralement et sont trouvées dans on VOCs de diffusion.

L'équipe conclut :

Nos résultats proposent que les mises à jour considérables pour l'amplicon très utilisé ordonnançant des plans soient nécessaires immédiatement, et que les plans d'amorce devront évoluer à côté de SARS-CoV-2. À long terme, notre combinaison d'analyse de PCR_strainer et de validation de laboratoire fournit une approche utile pour mettre à jour les protocoles SARS-CoV-2 de ordonnancement cliniques. »

avis *Important

le medRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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