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L'étude examine la réplication SARS-CoV-2 en cellules utilisant la microscopie de superbe-définition

En dépit des efforts énormes par la communauté scientifique globale pour limiter l'écart du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère, en développant des protocoles plus efficaces de contrôle, des traitements, et les vaccins rapidement, relativement peu est connus au sujet de la dynamique de la réplication SARS-CoV-2 dans des cellules.

Le recensement des mécanismes de boîte de vitesses et de réplication de SARS-CoV-2 est indispensable au développement des traitements efficaces et des vaccins et à la capacité de prévoir les conséquences à long terme de cette maladie, qui faciliteront le développement des contre-mesures contre l'évolution du virus.

Entrée SARS-CoV-2, synthèse des protéines, réplication, et sortie

SARS-CoV-2 est un virus enveloppé qui écrit les voies respiratoires par l'intermédiaire de l'interaction du domaine récepteur-grippant sur la protéine de la pointe SARS-CoV-2 et le récepteur de cellule hôte, l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE-2).

Le génome monocatenaire d'ARN du virus est alors déchargé dans la cellule hôte et est traduit. Deux grands cadres de lecture ouverts - ORF1a et ORF1ab - dans le génome sont traduits en grands composés de polyprotein - pp1a et pp1ab - qui sont goujon-de translation fendu pour produire 16 protéines non-structurelles. L'ORFs restant dans le génome codent les 4 protéines de structure de SARS-CoV-2.

Sur l'infection SARS-CoV-2, le virus déclenche la biogénèse des organelles de réplication (ROs) telles que les vésicules de double-membrane (DMVs), qui protègent l'ARN viral contre la dégradation par RNAses cellulaire pendant la réplication.

L'ensemble des virions viraux matures se produit dans le réticulum endoplasmique (ER) au compartiment intermédiaire de Golgi (ERGIC) et on dit que la sortie des coronaviruses se produit par l'intermédiaire de l'exocytose.

Les interactions des protéines SARS-CoV-2 avec des protéines de cellule hôte seulement ont été partiellement étudiées jusqu'ici, et peu est connu au sujet de la dynamique de la réplication SARS-CoV-2 dans les cellules.

En vérifiant la séquence d'opérations dans l'infection SARS-CoV-2 faites un cycle en concevant la dynamique spatio-temporelle des protéines de structure

Les chercheurs de l'université de Cambridge, R-U, ont récent vérifié et ont caractérisé la séquence d'opérations dans étapes variées du cycle de l'infection SARS-CoV-2 en concevant la dynamique spatio-temporelle des 4 protéines de structure du virus à la haute résolution.

Ils avaient l'habitude la microscopie à fluorescence avancée pour étudier la cinétique d'expression et l'agencement spatial des protéines de structure et de leurs interactions avec des compartiments de cellule hôte. Leur étude est publiée sur le serveur de prétirage de bioRxiv*.

Les chercheurs ont observé que l'expression de la protéine de structure SARS-CoV-2 est fortement stationnée, avec des différences marquées entre la nucléoprotéine et les 3 protéines de transmembrane. La nucléoprotéine est d'abord exprimée et s'accumule dans les couches 3D compliquées autour des membranes d'ER liées aux orientations de réplication de l'ARN SARS-CoV-2.

Avec l'aide de la représentation volumétrique, les auteurs ont confirmé qu'au moins une orientation d'ARN à double brin est habituellement liée à la couche extérieure du compartiment de protéine de N, qui a beaucoup de parties protégées par fusible.

Les découvertes offrent des analyses dans le règlement spatio-temporel de l'ensemble SARS-CoV-2 et raffinent la compréhension actuelle de la réplication virale

Les résultats prouvent que la protéine de N joue un bivalent - les formes non modifiées de protéine de N un oligomère structuré qui convient pour l'ensemble de nucleocapsid, et la protéine phosphorylée de N forme un compartiment comme un liquide pour le traitement du génome viral.

SARS-CoV-2 la protéine du nucleocapsid (n) est dispensée en structures posées qui hébergent des orientations de réplication d
SARS-CoV-2 la protéine du nucleocapsid (n) est dispensée en structures posées qui hébergent des orientations de réplication d'ARN et est fortement entrelacée avec la topologie du réticulum endoplasmique. A) La microscopie confocale prouve que la protéine de nucleocapsid forme les configurations punctate dans le cytosol des cellules infectées de Vero (bleu : noyaux ; magenta : protéine de nucleocapsid). Μm de la barre 10 d'écaille. Les nombres de points selon la cellule et l'augmentation de taille d'une façon étape-dépendante (le schéma de support 6). B) Une combinaison de l'extension et de la microscopie confocale prouve que certaines des structures des protéines plus grandes de nucleocapsid observées aux remarques postérieures de temps (de hpi 10 en circuit) se composent des doubles layers (flèche rouge). L'écaille barre 1 μm (tenant compte d'un facteur d'extension linéaire de 4,2). C) Une combinaison de l'extension et de la microscopie de nappe de lumière indique les structures des protéines compliquées de nucleocapsid, ici montrées en tant que projections maximum d'intensité. Chaque trait pointillé donne les limites de chaque structure des protéines compliquée de nucleocapsid. Μm de la barre 2 d'écaille (tenant compte d'un facteur d'extension de 4,2). D) L'analyse de distribution de grandeurs des compartiments de double couche de protéine de nucleocapsid a enregistré 12 heures de goujon-infection. La couche circulaire intérieure a un diamètre moyen de 275 nanomètre. 38 compartiments de 10 cellules se sont analysés. La taille du micrographe est le μm 1,25 selon le côté. E) Image représentative d'une cellule augmentée de Vero souillée pour le noyau (bleu), ER (protéine de calnexin, oranges), protéine de nucleocapsid (magenta) et ARN à double brin (bleu-vert), imagé sur un microscope confocal. Μm de la barre 5 d'écaille (tenant compte d'un facteur d'extension de 4,2). F) Détails de la protéine de nucleocapsid (magenta) et de l'ER (jaune), prouvant que la protéine de nucleocapsid forme des couches autour des membranes d'ER. Ceci indique que les structures des protéines de nucleocapsid pourraient être localisées aux vésicules de double-membrane (DMVs) ou aux paquets de DMVs. L'écaille barre 1 μm (tenant compte d'un facteur d'extension de 4,2). G) Une combinaison de l'extension et de la microscopie de nappe de lumière indique l'interaction entre l'ARN à double brin (bleu-vert) et la protéine N de nucleocapsid (magenta). Ceci prouve que les orientations d'ARN à double brin se reposent dans les couches des compartiments de N. Μm de la barre 5 d'écaille (tenant compte d'un facteur d'extension de 4,2). La taille des micrographes plus petits est le μm 5 selon le côté.

Les chercheurs ont constaté que des 3 protéines de transmembrane, la protéine de membrane atteint le Golgi apparatus/ERGIC avant les protéines d'enveloppe et de pointe.

La borne de lysosome, LAMP1 replace vers le compartiment d'ensemble et a été trouvée dans des vésicules de transport des protéines SARS-CoV-2, qui confirme la fonction clé des lysosomes dans la sortie SARS-CoV-2.

Bien qu'un passage d'un contrat à un appareillage réduit en fragments de Golgi ait été également trouvé, qui indique une pointe dans la sortie virale, la raison derrière cette fragmentation de l'appareillage de Golgi n'est pas apparente.

L
L'immunohistochimique des quatre protéines de structure de SARS-CoV-2 (nucleocapsid (n), pointe (s), membrane (m) et enveloppe (e)) était couronnée de succès pour tous les états de fixation et anticorps sélectés. Les cellules de Vero étaient transfecté pour exprimer chacune des quatre protéines virales. L'immunohistochimique était couronnée de succès pour tout le (formaldéhyde ou glyoxal) chimique de fixation et les états de permeabilization (triton X-100 ou saponine) ont vérifié. La configuration de protéine de pointe était différente en deux conditions de fixation vérifiés, bien qu'on n'ait pas remarqué cette différence dans les échantillons infectés. La protéine de Nucleocapsid a été trouvée utilisant un fluor 568 d'Alexa a conjugué l'anticorps secondaire ; la pointe, la membrane et les protéines d'enveloppe ont été trouvées utilisant le fluor 488 d'Alexa ont conjugué les anticorps secondaires. Glissière blanche : Protéines SARS-CoV-2 ; glissière bleue : noyaux DAPI-souillés. Toutes les illustrations montrées ont été acquises sur un microscope sur commande de large-inducteur. Barre d'écaille : μm 20.

Les auteurs croient que davantage de recherche est nécessaire pour analyser les facteurs contribuant à l'organisme défectueux des compartiments de Golgi.

Les découvertes de ce travail offrent des analyses neuves dans le règlement spatio-temporel de l'ensemble SARS-CoV-2 et raffinent la compréhension actuelle de la réplication de SARS-CoV-2.

« Nous envisageons que les méthodes présentées dans cette étude pourraient en outre être employées pour étudier le rôle des protéines non-structurelles de SARS-CoV-2, de la cinétique de la réplication de génome viral ainsi que de la relation entre l'ARN viral, de la protéine de N et des organelles de réplication virale. »

Une combinaison de l
Une combinaison de l'extension et de la microscopie de nappe de lumière indique l'interaction entre l'ARN à double brin (bleu-vert) et la protéine N de nucleocapsid (magenta) en cellules infectées de SARS-CoV-2 Vero. Le vidéo correspond pour figure 3G dans le manuscrit principal. La majorité d'orientations d'ARN à double brin sont plac dans une région immédiatement à côté du noyau. De plus, la plupart des compartiments de N contiennent des orientations d'ARN à double brin se reposant dans les couches des compartiments. Μm de la barre 5 d'écaille (tenant compte d'un facteur d'extension de 4,2).

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
  • The SARS-CoV-2 nucleocapsid protein associates with the replication organelles before viral assembly at the Golgi/ERGIC and lysosome-mediated egress, Katharina M. Scherer, Luca Mascheroni, George W. Carnell, Lucia C. S. Wunderlich, Stanislaw Makarchuk, Marius Brockhoff, Ioanna Mela, Ana Fernandez-Villegas, Max Barysevich, Hazel Stewart, Maria Suau Sans, Charlotte L. George, Jacob R. Lamb, Gabriele S. Kaminski-Schierle, Jonathan L. Heeney, Clemens F. Kaminski, bioRxiv, 2021.06.15.448497; doi: https://doi.org/10.1101/2021.06.15.448497, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.06.15.448497v1
Susha Cheriyedath

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Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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