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Lo studio esamina la replica SARS-CoV-2 in celle facendo uso di microscopia di super-risoluzione

Malgrado gli sforzi tremendi dalla comunità scientifica globale per porre freno la diffusione del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo, sviluppando i protocolli più efficienti di prova, le terapie ed i vaccini rapidamente, relativamente poco è conosciuta circa la dinamica della replica SARS-CoV-2 all'interno delle celle.

L'identificazione dei meccanismi della replica e della trasmissione di SARS-CoV-2 è vitale allo sviluppo di efficaci droghe e vaccini ed alla capacità predire le conseguenze a lungo termine di questa malattia, che aiuteranno nello sviluppo delle contromisure contro l'evoluzione del virus.

Entrata SARS-CoV-2, sintesi delle proteine, replica ed uscita

SARS-CoV-2 è un virus avvolto che fornisce le vie respiratorie via l'interazione del dominio dell'ricevitore-associazione sulla proteina della punta SARS-CoV-2 e sul recettore cellulare ospite, enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE-2).

Il genoma unico incagliato del RNA del virus poi è scaricato nella cellula ospite ed è tradotto. Due grandi fotogrammi di lettura aperti - ORF1a e ORF1ab - nel genoma sono tradotti in grandi complessi di poliproteico - pp1a e pp1ab - che sono post--di traduzione fenduti per produrre 16 proteine non strutturali. Il ORFs restante nel genoma codifica le 4 proteine strutturali di SARS-CoV-2.

Sopra l'infezione SARS-CoV-2, il virus avvia la biogenesi degli organelli della replica (ROs) quali le vescicole della doppio membrana (DMVs), che proteggono il RNA virale da degradazione da RNAses cellulare durante la replica.

Il montaggio dei virions virali maturi si presenta nel reticolo endoplasmatico (ER) al compartimento intermedio di Golgi (ERGIC) e l'uscita dei coronaviruses è detta per accadere via esocitosi.

Le interazioni delle proteine SARS-CoV-2 con le proteine della cellula ospite parzialmente sono state studiate soltanto finora e piccolo è conosciuto circa la dinamica della replica SARS-CoV-2 all'interno delle celle.

Studiando la serie di eventi nell'infezione SARS-CoV-2 cicli prevedendo la dinamica spazio-temporale delle proteine strutturali

I ricercatori dall'università di Cambridge, Regno Unito, recentemente hanno studiato e caratterizzato la serie di eventi in varie fasi del ciclo di infezione SARS-CoV-2 dal prevedere la dinamica spazio-temporale delle 4 proteine strutturali del virus all'alta risoluzione.

Hanno usato la microscopia di fluorescenza avanzata per studiare la cinetica di espressione e la disposizione spaziale delle proteine strutturali e delle loro interazioni con i compartimenti della cellula ospite. Il loro studio è pubblicato sul " server " della pubblicazione preliminare del bioRxiv*.

I ricercatori hanno osservato che l'espressione strutturale della proteina SARS-CoV-2 è messa in scena strettamente, con le profonde differenze fra la nucleoproteina e le 3 proteine del transmembrane. La nucleoproteina in primo luogo è espressa e si accumula in livelli complicati 3D intorno alle membrane di ER collegate ai fuochi della replica del RNA SARS-CoV-2.

Con l'aiuto della rappresentazione volumetrica, gli autori hanno confermato che almeno un fuoco del dsRNA è collegato solitamente al livello esterno del compartimento della proteina di N, che ha molte sezioni fuse.

I risultati offrono le comprensioni nel regolamento spazio-temporale dell'installazione SARS-CoV-2 e raffina la comprensione corrente della replicazione virale

I risultati indicano che la proteina di N gioca un bivalente - i moduli invariati della proteina di N un oligomero strutturato che è adatto ad installazione del nucleocapsid e la proteina fosforilata di N forma un compartimento del tipo di liquido per elaborare del genoma virale.

SARS-CoV-2 la proteina del nucleocapsid (n) è organizzata in strutture stratificate che ospitano i fuochi della replica del RNA e forte è intrecciata con la topologia del reticolo endoplasmatico. A) La microscopia confocale indica che la proteina del nucleocapsid forma i reticoli punctate nel cytosol delle celle infettate di Vero (blu: nuclei; magenta: proteina del nucleocapsid). Μm della barra 10 del disgaggio. I numeri dei puncta per aumento di dimensione e delle cellule in un modo fase-dipendente (figura supportante 6). B) Una combinazione di espansione e di microscopia confocale indica che alcune di più grandi strutture della proteina del nucleocapsid osservate ai punti successivi di tempo (dal hpi 10 sopra) consistono di doppi livelli (freccia rossa). Il disgaggio esclude 1 μm (che considera un fattore di espansione lineare di 4,2). C) Una combinazione di microscopia della lamiera sottile dell
SARS-CoV-2 la proteina del nucleocapsid (n) è organizzata in strutture stratificate che ospitano i fuochi della replica del RNA e forte è intrecciata con la topologia del reticolo endoplasmatico. A) La microscopia confocale indica che la proteina del nucleocapsid forma i reticoli punctate nel cytosol delle celle infettate di Vero (blu: nuclei; magenta: proteina del nucleocapsid). Μm della barra 10 del disgaggio. I numeri dei puncta per aumento di dimensione e delle cellule in un modo fase-dipendente (figura supportante 6). B) Una combinazione di espansione e di microscopia confocale indica che alcune di più grandi strutture della proteina del nucleocapsid osservate ai punti successivi di tempo (dal hpi 10 sopra) consistono di doppi livelli (freccia rossa). Il disgaggio esclude 1 μm (che considera un fattore di espansione lineare di 4,2). C) Una combinazione di espansione e di microscopia della luminoso lamiera sottile rivela le strutture complicate della proteina del nucleocapsid, qui indicate come proiezioni massime dell'intensità. Ogni linea punteggiata descrive i limiti di ogni struttura complicata della proteina del nucleocapsid. Μm della barra 2 del disgaggio (che considera un fattore di espansione di 4,2). D) L'analisi di distribuzione per ampiezza dei compartimenti del doppio livello della proteina del nucleocapsid ha registrato 12 ore di post-infezione. Il livello circolare interno ha un diametro medio di 275 nanometro. 38 compartimenti da 10 celle sono stati analizzati. La dimensione del micrografo è μm 1,25 per lato. E) Immagine rappresentativa di una cella ampliata di Vero macchiata per il nucleo (blu), il ER (proteina del calnexin, arancio), la proteina del nucleocapsid (magenta) e il dsRNA (ciano), imaged su un microscopio confocale. Μm della barra 5 del disgaggio (che considera un fattore di espansione di 4,2). F) Dettagli della proteina del nucleocapsid (magenta) e del ER (giallo), indicante che la proteina del nucleocapsid forma i livelli intorno alle membrane di ER. Ciò indica che le strutture della proteina del nucleocapsid potrebbero essere localizzate alle vescicole della doppio membrana (DMVs) o ai pacchetti di DMVs. Il disgaggio esclude 1 μm (che considera un fattore di espansione di 4,2). G) Una combinazione di espansione e di microscopia della luminoso lamiera sottile rivela l'interazione fra dsRNA (ciano) e la proteina N del nucleocapsid (magenta). Ciò indica che i fuochi del dsRNA si siedono nei livelli dei compartimenti di N. Μm della barra 5 del disgaggio (che considera un fattore di espansione di 4,2). La dimensione di più piccoli micrografi è μm 5 per lato.

I ricercatori hanno trovato che delle 3 proteine del transmembrane, la proteina della membrana raggiunge il Golgi apparatus/ERGIC prima delle proteine della punta e della busta.

L'indicatore del lisosoma, LAMP1 riassegna verso il compartimento dell'installazione ed è stato individuato in vescicole del trasporto delle proteine SARS-CoV-2, che conferma il ruolo chiave dei lisosomi nell'uscita SARS-CoV-2.

Sebbene una transizione da un compatto ad un apparato di Golgi spezzettato egualmente sia individuata, che indica una punta nell'uscita virale, la ragione dietro questa frammentazione dell'apparato di Golgi non è evidente.

Immunostaining delle quattro proteine strutturali di SARS-CoV-2 (nucleocapsid (n), la punta (s), la membrana (m) e la busta riuscivano per tutti gli stati di fissazione ed anticorpi selezionati. Le celle di Vero transfected per esprimere ciascuna delle quattro proteine virali. Immunostaining riusciva per tutta la (formaldeide o gliossale) chimica di fissazione e gli stati di permeabilization (tritone X-100 o saponina) hanno provato. Il reticolo della proteina della punta era differente nei due stati di fissazione provati, sebbene questa differenza non fosse notata nei campioni infettati. La proteina di Nucleocapsid è stata individuata facendo uso di un Fluor 568 di Alexa ha coniugato l
Immunostaining delle quattro proteine strutturali di SARS-CoV-2 (nucleocapsid (n), la punta (s), la membrana (m) e la busta (E)) riuscivano per tutti gli stati di fissazione ed anticorpi selezionati. Le celle di Vero transfected per esprimere ciascuna delle quattro proteine virali. Immunostaining riusciva per tutta la (formaldeide o gliossale) chimica di fissazione e gli stati di permeabilization (tritone X-100 o saponina) hanno provato. Il reticolo della proteina della punta era differente nei due stati di fissazione provati, sebbene questa differenza non fosse notata nei campioni infettati. La proteina di Nucleocapsid è stata individuata facendo uso di un Fluor 568 di Alexa ha coniugato l'anticorpo secondario; la punta, la membrana e le proteine di rivestimento sono state individuate facendo uso del Fluor 488 di Alexa hanno coniugato gli anticorpi secondari. Canale bianco: Proteine SARS-CoV-2; canale blu: nuclei DAPI-macchiati. Tutte le maschere indicate si sono acquistate su un microscopio su misura del ampio-campo. Barra del disgaggio: μm 20.

Gli autori ritengono che ulteriore ricerca sia necessaria analizzare i fattori che contribuiscono all'organizzazione difettosa dei compartimenti di Golgi.

I risultati di questo lavoro offrono le nuove comprensioni nel regolamento spazio-temporale dell'installazione SARS-CoV-2 e raffina la comprensione corrente della replica di SARS-CoV-2.

“Prevediamo che i metodi presentati in questo studio potrebbero ancora essere usati per lo studio del ruolo delle proteine non strutturali di SARS-CoV-2, della cinetica della replica virale del genoma come pure della relazione fra il RNA virale, della proteina di N e degli organelli della replicazione virale.„

Una combinazione di microscopia della lamiera sottile dell
Una combinazione di espansione e di microscopia della luminoso lamiera sottile rivela l'interazione fra dsRNA (ciano) e la proteina N del nucleocapsid (magenta) in celle di Vero infettate SARS-CoV-2. Il video corrisponde per calcolare 3G nel manoscritto principale. La maggior parte dei fuochi del dsRNA è posizionata immediatamente in una regione adiacente al nucleo. Inoltre, la maggior parte dei compartimenti di N contengono i fuochi del dsRNA che si siedono nei livelli dei compartimenti. Μm della barra 5 del disgaggio (che considera un fattore di espansione di 4,2).

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
  • The SARS-CoV-2 nucleocapsid protein associates with the replication organelles before viral assembly at the Golgi/ERGIC and lysosome-mediated egress, Katharina M. Scherer, Luca Mascheroni, George W. Carnell, Lucia C. S. Wunderlich, Stanislaw Makarchuk, Marius Brockhoff, Ioanna Mela, Ana Fernandez-Villegas, Max Barysevich, Hazel Stewart, Maria Suau Sans, Charlotte L. George, Jacob R. Lamb, Gabriele S. Kaminski-Schierle, Jonathan L. Heeney, Clemens F. Kaminski, bioRxiv, 2021.06.15.448497; doi: https://doi.org/10.1101/2021.06.15.448497, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.06.15.448497v1
Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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