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O estudo examina a réplica SARS-CoV-2 nas pilhas usando a microscopia da super-definição

Apesar dos esforços tremendos pela comunidade científica global para limitar a propagação do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), desenvolvendo uns protocolos mais eficientes do teste, as terapias, e as vacinas rapidamente, são sabidas relativamente pouco sobre a dinâmica da réplica SARS-CoV-2 dentro das pilhas.

Identificar os mecanismos da transmissão e da réplica de SARS-CoV-2 é vital à revelação de drogas e de vacinas eficazes e à capacidade prever as conseqüências a longo prazo desta doença, que ajudarão na revelação das medidas defensivas contra a evolução do vírus.

Entrada SARS-CoV-2, síntese da proteína, réplica, e saída

SARS-CoV-2 é um vírus envolvido que incorpore as vias respiratórias através da interacção do domínio receptor-obrigatório na proteína do ponto SARS-CoV-2 e no receptor da pilha de anfitrião, angiotensin-convertendo a enzima 2 (ACE-2).

O genoma único-encalhado do RNA do vírus então é liberado na pilha de anfitrião e traduzido. Dois grandes quadros de leitura abertos - ORF1a e ORF1ab - no genoma são traduzidos em grandes complexos do polyprotein - pp1a e pp1ab - que são cargo-translationally fendido para produzir 16 proteínas não-estruturais. O ORFs restante no genoma codifica as 4 proteínas estruturais de SARS-CoV-2.

Em cima da infecção SARS-CoV-2, o vírus provoca a biogénese dos organelles da réplica (ROs) tais como as vesículas da dobro-membrana (DMVs), que protegem o RNA viral da degradação por RNAses celular durante a réplica.

O conjunto de virions virais maduros ocorre no segundo estômago endoplasmic (ER) ao compartimento intermediário de Golgi (ERGIC) e a saída dos coronaviruses é dita acontecer através do exocytosis.

As interacções das proteínas SARS-CoV-2 com proteínas da pilha de anfitrião têm sido estudadas somente parcialmente até agora, e pouco é sabido sobre a dinâmica da réplica SARS-CoV-2 dentro das pilhas.

Investigando a seqüência de eventos na infecção SARS-CoV-2 dê um ciclo visualizando a dinâmica spatiotemporal das proteínas estruturais

Os pesquisadores da universidade de Cambridge, Reino Unido, recentemente investigaram e caracterizaram a seqüência de eventos em várias fases do ciclo da infecção SARS-CoV-2 visualizando a dinâmica spatiotemporal das 4 proteínas estruturais do vírus na alta resolução.

Usaram microscopia de fluorescência avançada para estudar a cinética da expressão e o regime espacial das proteínas estruturais e de suas interacções com os compartimentos de pilha do anfitrião. Seu estudo é publicado no server da pré-impressão do bioRxiv*.

Os pesquisadores observaram que a expressão estrutural da proteína SARS-CoV-2 está encenada firmemente, com diferenças marcadas entre o nucleoprotein e as 3 proteínas da transmembrana. O nucleoprotein primeiramente é expressado e acumula nas camadas 3D complicadas em torno das membranas do ER ligadas aos focos da réplica do RNA SARS-CoV-2.

Com a ajuda da imagem lactente volumétrico, os autores confirmaram que pelo menos um foco do dsRNA está ligado geralmente à camada exterior do compartimento da proteína de N, que tem muitas secções fundidas.

Os resultados oferecem introspecções no regulamento spatiotemporal do conjunto SARS-CoV-2 e refinam a compreensão actual da réplica viral

Os resultados mostram que a proteína de N jogam um bivalente - os formulários unmodified da proteína de N um oligómero estruturado que seja apropriado para o conjunto do nucleocapsid, e a proteína phosphorylated de N formam a líquido-como o compartimento para processar do genoma viral.

O nucleocapsid SARS-CoV-2 (N) a proteína é organizada nas estruturas mergulhadas que hospedam focos da réplica do RNA e entrelaçada fortemente com a topologia do segundo estômago endoplasmic. A) A microscopia Confocal mostra que a proteína do nucleocapsid forma testes padrões punctate no cytosol de pilhas contaminadas de Vero (azul: núcleos; magenta: proteína do nucleocapsid). Μm da barra 10 da escala. Os números de puncta pelo aumento da pilha e do tamanho em uma maneira fase-dependente (figura de apoio 6). B) Uma combinação de expansão e de microscopia confocal mostra que algumas das estruturas maiores da proteína do nucleocapsid observadas em uns pontos mais atrasados do tempo (do hpi 10 sobre) consistem em duplas camada (seta vermelha). A escala barra 1 μm (que leva em consideração um factor de expansão linear de 4,2). C) Uma combinação de microscopia da folha da expansão e da luz revela as estruturas complicadas da proteína do nucleocapsid, mostradas aqui como projecções máximas da intensidade. Cada linha pontilhada esboça os limites de cada estrutura complicada da proteína do nucleocapsid. Μm da barra 2 da escala (que leva em consideração um factor de expansão de 4,2). D) A análise da distribuição de tamanho dos compartimentos da dupla camada da proteína do nucleocapsid gravou 12 horas de cargo-infecção. A camada circular interna tem um diâmetro médio de 275 nanômetro. 38 compartimentos de 10 pilhas foram analisados. O tamanho da micrografia é o μm 1,25 pelo lado. E) Imagem representativa de uma pilha expandida de Vero manchada para o núcleo (azul), ER (proteína do calnexin, alaranjadas), proteína do nucleocapsid (magenta) e dsRNA (ciano), imaged em um microscópio confocal. Μm da barra 5 da escala (que leva em consideração um factor de expansão de 4,2). F) Detalhes da proteína do nucleocapsid (magenta) e do ER (amarelo), mostrando que a proteína do nucleocapsid forma camadas em torno das membranas do ER. Isto indica que as estruturas da proteína do nucleocapsid puderam ser localizadas nas vesículas da membrana ou em pacotes dobro de DMVs. A escala barra 1 μm (que leva em consideração um factor de expansão de 4,2). G) Uma combinação de microscopia da folha da expansão e da luz revela a interacção entre o dsRNA (ciano) e a proteína N do nucleocapsid (magenta). Isto mostra que os focos do dsRNA se sentam nas camadas dos compartimentos de N. Μm da barra 5 da escala (que leva em consideração um factor de expansão de 4,2). O tamanho das micrografia menores é o μm 5 pelo lado.
O nucleocapsid SARS-CoV-2 (N) a proteína é organizada nas estruturas mergulhadas que hospedam focos da réplica do RNA e entrelaçada fortemente com a topologia do segundo estômago endoplasmic. A) A microscopia Confocal mostra que a proteína do nucleocapsid forma testes padrões punctate no cytosol de pilhas contaminadas de Vero (azul: núcleos; magenta: proteína do nucleocapsid). Μm da barra 10 da escala. Os números de puncta pelo aumento da pilha e do tamanho em uma maneira fase-dependente (figura de apoio 6). B) Uma combinação de expansão e de microscopia confocal mostra que algumas das estruturas maiores da proteína do nucleocapsid observadas em uns pontos mais atrasados do tempo (do hpi 10 sobre) consistem em duplas camada (seta vermelha). A escala barra 1 μm (que leva em consideração um factor de expansão linear de 4,2). C) Uma combinação de expansão e de microscopia da luz-folha revela as estruturas complicadas da proteína do nucleocapsid, mostradas aqui como projecções máximas da intensidade. Cada linha pontilhada esboça os limites de cada estrutura complicada da proteína do nucleocapsid. Μm da barra 2 da escala (que leva em consideração um factor de expansão de 4,2). D) A análise da distribuição de tamanho dos compartimentos da dupla camada da proteína do nucleocapsid gravou 12 horas de cargo-infecção. A camada circular interna tem um diâmetro médio de 275 nanômetro. 38 compartimentos de 10 pilhas foram analisados. O tamanho da micrografia é o μm 1,25 pelo lado. E) Imagem representativa de uma pilha expandida de Vero manchada para o núcleo (azul), ER (proteína do calnexin, alaranjadas), proteína do nucleocapsid (magenta) e dsRNA (ciano), imaged em um microscópio confocal. Μm da barra 5 da escala (que leva em consideração um factor de expansão de 4,2). F) Detalhes da proteína do nucleocapsid (magenta) e do ER (amarelo), mostrando que a proteína do nucleocapsid forma camadas em torno das membranas do ER. Isto indica que as estruturas da proteína do nucleocapsid puderam ser localizadas nas vesículas da dobro-membrana (DMVs) ou nos pacotes de DMVs. A escala barra 1 μm (que leva em consideração um factor de expansão de 4,2). G) Uma combinação de expansão e de microscopia da luz-folha revela a interacção entre o dsRNA (ciano) e a proteína N do nucleocapsid (magenta). Isto mostra que os focos do dsRNA se sentam nas camadas dos compartimentos de N. Μm da barra 5 da escala (que leva em consideração um factor de expansão de 4,2). O tamanho das micrografia menores é o μm 5 pelo lado.

Os pesquisadores encontraram que das 3 proteínas da transmembrana, a proteína da membrana alcança o Golgi apparatus/ERGIC antes das proteínas do envelope e do ponto.

O marcador do lisosoma, LAMP1 relocates para o compartimento do conjunto e foi detectado nas vesículas do transporte das proteínas SARS-CoV-2, que confirma o papel chave dos lisosomas na saída SARS-CoV-2.

Embora uma transição de um estojo compacto a um instrumento fragmentado de Golgi seja detectada igualmente, que indique um ponto na saída viral, a razão atrás desta fragmentação do instrumento de Golgi não é aparente.

Immunostaining das quatro proteínas estruturais de SARS-CoV-2 (nucleocapsid (N), ponto (s), membrana (M) e envelope (e)) era bem sucedido para todas as condições da fixação e anticorpos selecionados. As pilhas de Vero transfected para expressar cada um das quatro proteínas virais. Immunostaining era bem sucedido para todo o (formaldeído ou glyoxal químico) da fixação e as condições do permeabilization (triton X-100 ou o saponin) testaram. O teste padrão da proteína do ponto era diferente nas duas condições da fixação testadas, embora esta diferença não fosse observada nas amostras contaminadas. A proteína de Nucleocapsid foi detectada usar um Fluor 568 de Alexa conjugou o anticorpo secundário; o ponto, a membrana e as proteínas de envelope foram detectados usar o Fluor 488 de Alexa conjugaram anticorpos secundários. Canal branco: Proteínas SARS-CoV-2; canal azul: núcleos DAPI-manchados. Todas as imagens mostradas foram adquiridas em um microscópio feito por encomenda do widefield. Barra da escala: μm 20.
Immunostaining das quatro proteínas estruturais de SARS-CoV-2 (nucleocapsid (N), ponto (s), membrana (M) e envelope (e)) era bem sucedido para todas as condições da fixação e anticorpos selecionados. As pilhas de Vero transfected para expressar cada um das quatro proteínas virais. Immunostaining era bem sucedido para todo o (formaldeído ou glyoxal químico) da fixação e as condições do permeabilization (triton X-100 ou o saponin) testaram. O teste padrão da proteína do ponto era diferente nas duas condições da fixação testadas, embora esta diferença não fosse observada nas amostras contaminadas. A proteína de Nucleocapsid foi detectada usar um Fluor 568 de Alexa conjugou o anticorpo secundário; o ponto, a membrana e as proteínas de envelope foram detectados usar o Fluor 488 de Alexa conjugaram anticorpos secundários. Canal branco: Proteínas SARS-CoV-2; canal azul: núcleos DAPI-manchados. Todas as imagens mostradas foram adquiridas em um microscópio feito por encomenda do largo-campo. Barra da escala: μm 20.

Os autores acreditam que uma pesquisa mais adicional é necessário analisar os factores que contribuem à organização defeituosa dos compartimentos de Golgi.

Os resultados deste trabalho oferecem introspecções novas no regulamento spatiotemporal do conjunto SARS-CoV-2 e refinam a compreensão actual da réplica de SARS-CoV-2.

“Nós prevemos que os métodos apresentados neste estudo poderiam além disso ser usados estudando o papel das proteínas não-estruturais de SARS-CoV-2, da cinética da réplica viral do genoma assim como do relacionamento entre o RNA viral, da proteína de N e dos organelles virais da réplica.”

Uma combinação de microscopia da folha da expansão e da luz revela a interacção entre o dsRNA (ciano) e a proteína N do nucleocapsid (magenta) em pilhas contaminadas SARS-CoV-2 de Vero. O vídeo corresponde para figurar 3G no manuscrito principal. A maioria de focos do dsRNA é ficada em uma região imediatamente junto ao núcleo. Além, a maioria de compartimentos de N contêm os focos do dsRNA que sentam-se nas camadas dos compartimentos. Μm da barra 5 da escala (que leva em consideração um factor de expansão de 4,2).
Uma combinação de expansão e de microscopia da luz-folha revela a interacção entre o dsRNA (ciano) e a proteína N do nucleocapsid (magenta) em pilhas contaminadas SARS-CoV-2 de Vero. O vídeo corresponde para figurar 3G no manuscrito principal. A maioria de focos do dsRNA é ficada em uma região imediatamente junto ao núcleo. Além, a maioria de compartimentos de N contêm os focos do dsRNA que sentam-se nas camadas dos compartimentos. Μm da barra 5 da escala (que leva em consideração um factor de expansão de 4,2).

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
  • The SARS-CoV-2 nucleocapsid protein associates with the replication organelles before viral assembly at the Golgi/ERGIC and lysosome-mediated egress, Katharina M. Scherer, Luca Mascheroni, George W. Carnell, Lucia C. S. Wunderlich, Stanislaw Makarchuk, Marius Brockhoff, Ioanna Mela, Ana Fernandez-Villegas, Max Barysevich, Hazel Stewart, Maria Suau Sans, Charlotte L. George, Jacob R. Lamb, Gabriele S. Kaminski-Schierle, Jonathan L. Heeney, Clemens F. Kaminski, bioRxiv, 2021.06.15.448497; doi: https://doi.org/10.1101/2021.06.15.448497, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.06.15.448497v1
Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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