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Uma plataforma cryo-correlativa da multi-escala à imagem SARS-CoV-2 em pilhas de Vero

O coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), que é o vírus responsável para a doença 2019 do coronavirus (COVID-19), é um vírus positivo-encalhado altamente infeccioso do ácido ribonucléico (RNA) que pertence à família Coronaviridae. Entre vírus do RNA, os coronaviruses contêm o genoma o maior e são associados com os processos complexos da réplica.

A complexidade da réplica do coronavirus é porque este processo envolve a SHIFT do quadro que desliza, durante que o replicase salta e os duplex múltiplos do RNA são gerados. Coronaviruses igualmente desenvolve compartimentos numerosos da membrana para proteger seus componentes virais, que aumenta a eficiência da réplica e ajuda estes vírus a iludir o reconhecimento imune inato.

Estudo:  A cryo-imagem lactente correlativa da multi-escala revela o conjunto SARS-CoV-2 e a saída. Crédito de imagem: CROCOTHERY/Shutterstock.com

As proteínas estruturais de SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 consiste em quatro proteínas estruturais diferentes, que incluem o ponto (s), membrana (M), envelope (e), e nucleocapsid (N) proteínas. A função preliminar da proteína de S, que consiste nos domínios S1 e S2, é negociar a entrada do vírus na pilha de anfitrião.

A infecção SARS-CoV-2 envolve duas etapas da pre-fusão e da cargo-fusão. Considerando que a pre-fusão envolve as subunidades S1 e S2, o último envolve a subunidade S2 apenas.

O papel principal da proteína de SARS-CoV-2 N é encapsulando e de protecção o genoma viral. A proteína de E é a proteína estrutural a menor e actua como um canal do íon. Última, a proteína da transmembrana M, que é a proteína estrutural o mais abundante actual em SARS-CoV-2, alinha a superfície interna da membrana do lipido do vírus.

Ciclo da réplica SARS-CoV-2   

A primeira etapa da infecção SARS-CoV-2 envolve a interacção entre proteína de S do vírus' e o receptor deconversão da enzima 2 (ACE2) actual na superfície da pilha de anfitrião. Subseqüentemente, S2 qualquer um fende-se na superfície da pilha na presença do protease TMPRSS2 da pilha ou provoca-se o endocytosis das partículas virais na ausência de TMPRSS2.

Quando os componentes virais são introduzidos no citoplasma da pilha de anfitrião, os polyproteins Pp1a e Pp1ab do precursor estão sintetizados. As proteínas SARS-CoV-2 não-estruturais gostam de nsp3, nsp4, e nsp6 induzem prontamente a formação de compartimentos membranosos chamados as vesículas da dobro-membrana (DMVs). Os processos virais da réplica e da transcrição do genoma ocorrem dentro destes compartimentos membranosos.

Os cientistas são curiosos sobre o mecanismo por que alcance de RNAs do mensageiro (mRNAs) o citoplasma a ser traduzido pelos ribosomes celulares de DMVs selado. Um estudo recente no coronavirus murine da hepatite (MHV) e no SARS-CoV-2 relatou a presença de um poro molecular que servisse como um portal da exportação para transferir cópias virais do genoma do mRNA e da positivo-costa.

Os estudos precedentes igualmente relataram que o conjunto das partículas virais ocorre nas membranas celulares alteradas derivadas do segundo estômago endoplasmic (ER), Golgi, e ER-Golgi o compartimento intermediário (ERGIC). Estes estudos promovem adicionado que o vírus obtem liberado através do exocytosis.

Embora a pesquisa extensiva seja conduzida nos componentes estruturais de SARS-CoV-2, há uma quantidade limitada de evidência estrutural e ultrastructural em como a infecção SARS-CoV-2 progride em pilhas nativas. Adicionalmente, há uma diferença na pesquisa relativa à compreensão do conjunto viral e da saída.

Uma multi-escala, plataforma cryo-correlativa para visualizar a infecção SARS-CoV-2

Um estudo novo publicado em comunicações da natureza correlacionou os episódios cytopathic provocados por SARS-CoV-2 com os processos da réplica do vírus em pilhas congelar-hidratadas. Os autores deste estudo usaram uma técnica original correlativa, multi-modal, e da multi-escala da cryo-imagem lactente para examinar o progresso da réplica de SARS-CoV-2 usando pilhas de Vero.

A técnica utilizada no estudo actual é original porque fornece uma imagem holística da infecção SARS-CoV-2 que inclui a pilha inteira fundida às moléculas individuais do ponto do vírus. Esta aproximação igualmente revelou os caminhos associados com o conjunto do vírus, assim como os efeitos do saída e os cytopathic da infecção SARS-CoV-2.

Neste estudo, os pesquisadores combinaram as técnicas diferentes que incluem a série de série do cryo microscopia de elétron focalizada da exploração do feixe de íon com a microscopia de elétron da exploração (cryoFIB/SEM) e o tomografia do raio X macio para estudar a morfologia da inteiro-pilha. Os dados obtidos destas técnicas foram correlacionados então com o tomografia de alta resolução do cryo-elétron (cryoET). Uma das vantagens do cryoET é o uso de circunstâncias congelar-hidratadas que oferece a preparação rápida e simples da amostra.

As imagens obtidas na réplica de SARS-CoV-2 revelaram um processo espacial bem organizado e altamente eficiente. Os cientistas observaram que cada etapa do processo da réplica que inclui a réplica do genoma, a síntese da proteína, e o conjunto do vírus, para nomear alguns, ocorre em compartimentos citoplasmáticas específicos.

Fatias representativas do A-D cryoFIB/SEM de uma pilha de SARS-CoV-2-infected na periferia da pilha (a), no citoplasma (b), no núcleo de pilha (c), e na invaginação do citoplasma no espaço nuclear (nota, de uma pilha diferente) (d). Escale barras, 500   nanômetro na corrente alternada, 1 µm do   em D. Preto e as partículas das setas do vermelho, as extracelulares e as intracelulares do vírus, respectivamente; setas azuis, poros nucleares; setas cor-de-rosa, compartimento complexo da membrana; seta roxa tracejada, trajecto da invaginação. V as vesículas, T escavam um túnel, núcleo de Nuc, citoplasma de Cyto, segundo estômago endoplasmic do ER. E surge a rendição do volume segmentado de pilha de SARS-CoV-2-infected mostrado na corrente alternada. Os organelles e as partículas segmentados do vírus são etiquetados com as cores indicadas. As linhas tracejadas (E, painel do superior esquerdo) indicam as posições das fatias mostradas na corrente alternada, respectivamente.

Uma ideia da multi-escala da réplica do genoma SARS-CoV-2

Os pesquisadores deste estudo ilustraram cinco etapas diferentes associadas com a réplica do genoma SARS-CoV-2, que inclui:

  • Etapa 1: A réplica do RNA ocorre em DMVs, assim separando o vRNA e o mRNA subgenomic da resposta imune inata de pilha de anfitrião.
  • Etapa 2: Os vRNAs recentemente sintetizados são transportados de DMVs aos locais do conjunto do vírus através dos portais da transmembrana. Os mRNAs são transportados igualmente pelos mesmos portais ao citoplasma, onde produz proteínas.
  • Etapa 3: As proteínas virais de S são transportadas aos locais do conjunto através das vesículas pequenas do transporte.
  • Etapa 4: Estas vesículas fundem com as únicas vesículas da membrana (SMV), que é onde os pontos virais recolhem no local do conjunto e o processo de brotamento começa. Estes eventos ocorrem na presença do vRNA. As proteínas de N são formadas igualmente nesta etapa.
  • Etapa 5: Após o conjunto e os processos de brotamento, uma vesícula decontenção é formada que possa conter partículas múltiplas do vírus. Estas partículas podem então retirar com os túneis ou o exocytosis lysosomal.

(1) a réplica viral do genoma ocorre dentro do DMVs, gerando a negativo-costa viral e RNAs subgenomic (vermelho), a cópia genomic do vRNA positivo, e os mRNAs subgenomic (azuis). (2) RNAs positivo é exportado para o citoplasma através dos poros de DMV. Os mRNAs de Subgenomic são traduzidos (2b). Proteínas estruturais M, associado de E, e de S com ER e membranas de Golgi. O vRNA Genomic torna-se complexed com N recentemente synthetized (2a). (3) S, E, e M são transportados nas vesículas densas, que são fundidas com SMVs. (4) O conjunto viral produtivo acontece no SMV que aglomera os pontos virais e que encapsidating o genoma em RNPs. Os vírus brotam ao espaço interno do SMV. (5) A saída ocorre através dos túneis. O compartimento complexo da membrana (CMC) é descrito no verde, que encerra partículas decontenção do vírus do postfusion e partículas decontenção do vírus do prefusion. DMV dobram a vesícula da membrana, SMV escolhem a vesícula da membrana, compartimento complexo da membrana do CMC, grande vesícula decontenção de LVCV.

Journal reference:
Dr. Priyom Bose

Written by

Dr. Priyom Bose

Priyom holds a Ph.D. in Plant Biology and Biotechnology from the University of Madras, India. She is an active researcher and an experienced science writer. Priyom has also co-authored several original research articles that have been published in reputed peer-reviewed journals. She is also an avid reader and an amateur photographer.

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