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Les chercheurs de Stanford conçoivent un système efficace, polyvalent, mini de CRISPR

L'analogie courante pour la retouche de gène de CRISPR est que cela fonctionne comme les ciseaux moléculaires, coupant les parties choisies d'ADN. Le Qi de Stanley, professeur adjoint de la bio-ingénierie à l'Université de Stanford, les goûts que l'analogie, mais lui les pense est temps au reimagine CRISPR comme couteau militaire suisse.

« CRISPR peut être aussi simple comme coupeur, ou davantage avancé en tant qu'un régulateur, un éditeur, un étiqueteur ou encre en poudre. Beaucoup d'applications apparaissent de cet inducteur passionnant, » a dit le Qi, qui est également un professeur adjoint de biologie de produit chimique et de systèmes dans l'École de Médecine de Stanford et un chercheur d'institut de Stanford ChEM-H.

Les nombreux différents systèmes de CRISPR en service ou étant cliniquement vérifié pour la thérapie génique des maladies dans l'oeil, le foie et le cerveau, cependant, demeurent limités dans leur étendue parce qu'ils tous souffrent du même vice de procédure : ils sont trop grands et, en conséquence, trop difficiles de livrer dans des cellules, des tissus ou des organismes vivants.

En septembre publié de papier 3 en cellule moléculaire, le Qi et ses collaborateurs annoncent que ce qu'ils croient est un pas en avant important pour CRISPR : Un système efficace, polyvalent, mini de CRISPR. Considérant que les systèmes utilisés généralement de CRISPR - avec des noms comme Cas9 et Cas12a indiquant des versions variées des protéines (Cas) CRISPR-associées - sont faits d'environ 1000 à 1500 acides aminés, leur « CasMINI » a 529.

Les chercheurs confirmés dans les expériences que CasMINI pourrait effacer, activer et éditer code génétique juste comme ses homologues plus costaudes. Ses moyens plus de petite taille il devrait être plus facile de livrer dans les cellules humaines et le corps humain, lui effectuant un outil potentiel pour traiter de divers mal, y compris la maladie oculaire, la dégénérescence d'organe et les maladies génétiques généralement.

Effort persistant

Pour rendre le système aussi petit comme possible, les chercheurs ont décidé de commencer par la protéine Cas12f de CRISPR (également connu sous le nom de Cas14), parce qu'il contient seulement les environ 400 à 700 acides aminés. Cependant, comme d'autres protéines de CRISPR, Cas12f provient naturellement des archéobactéries - organismes unicellulaires - qui des moyens qu'il n'est pas bien adapté aux cellules mammifères, sans parler des cellules humaines ou des fuselages. Seulement quelques protéines de CRISPR sont connues pour fonctionner en cellules mammifères sans modification. Malheureusement, CAS12f n'est pas l'une d'entre elles. Ceci lui effectue un défi de attraction pour des bioengineers comme le Qi.

Nous avons pensé, « en bon état, des millions d'années d'évolution n'avons pas pu transformer ce système de CRISPR en quelque chose ce des fonctionnements au corps humain. Pouvons-nous changer cela pendant juste un ou deux années ? « À ma connaissance, nous avons pour la première fois transformé un CRISPR non-travaillant en fonctionnant. »

Qi de Stanley, professeur adjoint d'université de BioengineeringStanford

En effet, Xiaoshu Xu, un chercheur post-doctoral dans le laboratoire de Qi et l'auteur important du papier, n'ont vu aucune activité du Cas12f naturel en cellules humaines. Xu et Qi ont présumé que l'édition était que le génome humain ADN est plus compliqué et moins accessible que l'ADN microbien, le rendant dur pour que Cas12f trouve son objectif en cellules. En regardant la structure de calcul prévue du système de Cas12f, il a soigneusement choisi environ 40 mutations dans la protéine qui pourrait potentiellement dériver cette limitation et a déterminé un pipeline pour vérifier beaucoup de variantes de protéine à la fois. Une variante fonctionnante, dans la théorie, tournerait un vert de cellule humaine en activant la protéine fluorescente verte (GFP) en son génome.

« Au début, ce système n'a pas fonctionné du tout pendant une année, » Xu a dit. « Mais après des itérations de la bio-ingénierie, nous avons vu quelques protéines conçues commencer à s'allumer, comme la magie. Elle nous a incités réellement à apprécier le pouvoir de la biologie et de la bio-ingénierie synthétiques. »

Les premiers résultats couronnés de succès étaient modestes, mais ils ont excité Xu et l'ont encouragée à pousser en avant parce qu'il a signifié le système fonctionné. Au-dessus de beaucoup d'itérations complémentaires, il pouvait améliorer davantage le rendement de la protéine. « Nous avons commencé par voir seulement deux cellules montrer un signe vert, et maintenant après avoir conçu, presque chaque cellule est verte sous le microscope, » Xu a dit.

« À un certain moment, j'ai dû l'arrêter, » Qi indiqué. « J'ai dit « qu'est bon pour l'instant. Vous avez effectué un système assez bon. Nous devrions penser à la façon dont cette molécule peut être employée pour des applications. «  »

En plus du bureau d'études de protéine, les chercheurs ont également conçu l'ARN qui guide la protéine de Cas à son objectif ADN. Les modifications aux deux composantes étaient essentielles à effectuer le travail de système de CasMINI en cellules humaines. Elles ont vérifié la capacité de CasMINI d'effacer et éditer des gènes dans les cellules humaines, y compris des gènes a associé à l'infection à VIH, la réaction immunitaire antitumorale et l'anémie basées sur laboratoire. Cela a fonctionné sur presque chaque gène qu'elles ont testé, avec des réactions robustes dans plusieurs.

Ouverture de la trappe

Les chercheurs ont déjà commencé à assembler des collaborations par d'autres scientifiques pour poursuivre des thérapies géniques. Ils sont également intéressés à la façon dont ils pourraient contribuer aux avances en technologies d'ARN - comme ce qui a été employé pour développer les vaccins d'ARNm COVID-19 - où la taille peut également être un facteur limitatif.

« Cette capacité de concevoir ces systèmes a été désirée dans le domaine depuis les premiers jours de CRISPR, et je me sens comme nous faisions notre partie pour déménager vers cette réalité, » ai dit le Qi. « Et cette approche de bureau d'études peut être tellement grand utile. C'est ce qui m'excite - ouverture de la trappe sur des possibilités neuves. »

Source:
Journal reference:

Xu, X., et al. (2021) Engineered Miniature CRISPR-Cas System for Mammalian Genome Regulation and Editing. Molecular Cell. doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.008.