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I ricercatori di Stanford costruiscono un sistema efficiente, multiuso, mini di CRISPR

L'analogia comune per modificare del gene di CRISPR è che funziona come le forbici molecolari, taglianti le sezioni selezionate di DNA. Stanley Qi, assistente universitario della bioingegneria alla Stanford University, simili che l'analogia, ma lui lo pensa è tempo al reimagine CRISPR come coltello di esercito svizzero.

“CRISPR può essere semplice come tagliatrice, o di più avanzato come un regolatore, un editore, un etichettatore o toner. Molte applicazioni stanno emergendo da questo campo emozionante,„ ha detto Qi, che è egualmente un assistente universitario di biologia di sistemi e del prodotto chimico nella scuola di medicina di Stanford ed in uno studioso dell'istituto di Stanford ChEM-H.

I molti sistemi differenti di CRISPR in uso o clinicamente essendo provando a terapia genica delle malattie nell'occhio, nel fegato e nel cervello, tuttavia, rimangono limitati nella loro portata perché tutti soffrono dallo stesso difetto: sono troppo grandi e, pertanto, troppo duri da consegnare nelle celle, nei tessuti o negli organismi viventi.

Nel 3 settembre pubblicato documento in cella molecolare, Qi ed i suoi collaboratori annunciano che che cosa credono è un passo avanti importante per CRISPR: Un sistema efficiente, multiuso, mini di CRISPR. Considerando che i sistemi comunemente usati di CRISPR - con i nomi come Cas9 e Cas12a che denotano le varie versioni delle proteine (Cas) CRISPR-associate - sono fatti di circa 1000 - 1500 amminoacidi, il loro “CasMINI„ ha 529.

I ricercatori confermati negli esperimenti che CasMINI potrebbe cancellare, attivare e modificare codice genetico appena come le sue controparti più muscolose. I sui mezzi più di piccola dimensione dovrebbe essere più facile da consegnare nelle cellule umane e nel corpo umano, rendentegli uno strumento potenziale per il trattamento dei disturbi diversi, compreso la malattia dell'occhio, la degenerazione dell'organo e le malattie genetiche generalmente.

Sforzo persistente

Per rendere il sistema piccolo come possibile, i ricercatori hanno deciso di cominciare con la proteina Cas12f di CRISPR (anche conosciuto come Cas14), perché contiene i soltanto circa 400 - 700 amminoacidi. Tuttavia, come altre proteine di CRISPR, Cas12f proviene naturalmente da Archaea - organismi unicellulari - che mezzi che non è ben adattato alle cellule di mammiferi, per non parlare delle cellule umane o degli organismi. Soltanto alcune proteine di CRISPR sono conosciute per lavorare in cellule di mammiferi senza modifica. Purtroppo, CAS12f non è una di loro. Ciò le rende una sfida attirante per i bioengineers come Qi.

Abbiamo pensato, “giusto, milioni di anni di evoluzione non abbiamo potuti trasformare questo sistema di CRISPR in qualcosa quel funzioni nel corpo umano. Possiamo cambiare quello durante appena uno o due anno? “Per quanto sappia, per la prima volta, abbiamo trasformato un CRISPR nonworking in di lavoro.„

Stanley Qi, assistente universitario dell'università di BioengineeringStanford

Effettivamente, Xiaoshu Xu, uno studioso postdottorale nel laboratorio di Qi e l'autore principale del documento, non hanno veduto attività del Cas12f naturale in cellule umane. Xu e Qi hanno supposto che l'emissione fosse che il DNA del genoma umano è più complicato e meno accessibile che il DNA microbico, rendente lo duro affinchè Cas12f trovasse il suo obiettivo in celle. Esaminando la struttura informaticamente preveduta del sistema di Cas12f, ha scelto con attenzione circa 40 mutazioni nella proteina che potrebbe potenzialmente oltrepassare questa limitazione ed ha stabilito una conduttura per verificare molte varianti della proteina per volta. Una variante di lavoro, nella teoria, girerebbe un verde della cellula umana attivando la proteina fluorescente verde (GFP) in suo genoma.

“Inizialmente, questo sistema non ha funzionato affatto per un anno,„ Xu ha detto. “Ma dopo le ripetizioni della bioingegneria, abbiamo veduto alcune proteine costruite cominciare accendere, come magia. Ci ha incitati realmente ad apprezzare la potenza di biologia e della bioingegneria sintetiche.„

I primi riusciti risultati erano modesti, ma hanno eccitato Xu e la hanno incoraggiata a fare avanzare perché ha significato il sistema lavorato. Sopra molte ripetizioni supplementari, poteva più ulteriormente migliorare la prestazione della proteina. “Abbiamo cominciato con vedere soltanto due celle mostrare un segnale verde ed ora dopo l'organizzazione, quasi ogni cella è verde sotto il microscopio,„ Xu ha detto.

“Ad un certo momento, ho dovuto fermarlo,„ Qi richiamato. “Ho detto “che è buono per ora. Avete fatto niente male un sistema. Dovremmo pensare a come questa molecola può essere usata per le applicazioni. “„

Oltre ad assistenza tecnica della proteina, i ricercatori egualmente hanno costruito il RNA che guida la proteina di Cas al suo DNA dell'obiettivo. Le modifiche ad entrambe le componenti erano determinanti per la fabbricazione del lavoro del sistema di CasMINI in cellule umane. Hanno verificato la capacità di CasMINI di cancellare e modificare i geni ain cellule umane, compreso i geni si è riferito ad infezione HIV, ain risposta immunitaria antitumorale ed all'nell'anemia basate a laboratorio. Ha lavorato a quasi ogni gene che hanno analizzato, con le risposte robuste in vari.

Apertura della porta

I ricercatori già hanno cominciato a montare le collaborazioni con altri scienziati per perseguire le terapie geniche. Egualmente sono interessati a come potrebbero contribuire agli avanzamenti nelle tecnologie del RNA - come che cosa è stato usato per sviluppare i vaccini del mRNA COVID-19 - dove la dimensione può anche essere un fattore limitante.

“Questa capacità di costruire questi sistemi è stata desiderata nel campo dai primi tempi di CRISPR e ritengo come abbiamo fatto la nostra parte per avanzare verso quella realtà,„ ho detto Qi. “E questo approccio di assistenza tecnica può essere così largamente utile. Quello è che cosa mi eccita - aprire la porta sulle nuove possibilità.„

Source:
Journal reference:

Xu, X., et al. (2021) Engineered Miniature CRISPR-Cas System for Mammalian Genome Regulation and Editing. Molecular Cell. doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.008.