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Os pesquisadores de Stanford projectam um sistema eficiente, de múltiplos propósitos, mini de CRISPR

A analogia comum para a edição do gene de CRISPR é que trabalha como as tesouras moleculars, cortando secções seletas do ADN. Stanley Qi, professor adjunto da tecnologia biológica na Universidade de Stanford, os gostos que a analogia, mas os pensa é tempo ao reimagine CRISPR como um canivete suíço.

“CRISPR pode ser tão simples quanto um cortador, ou avançado mais como um regulador, um editor, um labeler ou o tonalizador. Muitas aplicações estão emergindo deste campo emocionante,” disse Qi, que é igualmente um professor adjunto da biologia do produto químico e de sistemas na Faculdade de Medicina de Stanford e em um erudito do instituto de Stanford ChEM-H.

Muitos sistemas diferentes de CRISPR no uso ou que estão sendo testados clìnica para a terapia genética das doenças no olho, no fígado e no cérebro, contudo, permanecem limitados em seu espaço porque todos sofrem da mesma falha: são demasiado grandes e, conseqüentemente, demasiado duros de entregar em pilhas, em tecidos ou em organismos vivos.

Em um papel publicado Sept. 3 na pilha molecular, Qi e seus colaboradores anunciam que o que acredita está uma etapa principal para a frente para CRISPR: Um sistema eficiente, de múltiplos propósitos, mini de CRISPR. Considerando que os sistemas de uso geral de CRISPR - com nomes como Cas9 e Cas12a que denotam várias versões de proteínas (Cas) CRISPR-associadas - são feitos de aproximadamente 1000 a 1500 ácidos aminados, seu “CasMINI” tem 529.

Os pesquisadores confirmados nas experiências que CasMINI poderia suprimir, para activar e editar o código genético apenas como suas contrapartes mais beefier. Seus meios menores do tamanho deve ser mais fácil entregar em pilhas humanas e no corpo humano, fazendo lhe uma ferramenta potencial para tratar doenças diversas, incluindo a doença de olho, a degeneração do órgão e doenças genéticas geralmente.

Esforço persistente

Para fazer o sistema tão pequeno como possível, os pesquisadores decidiram começar com a proteína Cas12f de CRISPR (igualmente conhecido como Cas14), porque contem somente aproximadamente 400 a 700 ácidos aminados. Contudo, como outras proteínas de CRISPR, Cas12f origina naturalmente de Archaea - organismos único-celulados - que meios que bem-não é serido às pilhas mamíferas, muito menos pilhas humanas ou corpos. Somente algumas proteínas de CRISPR são sabidas para trabalhar em pilhas mamíferas sem alteração. Infelizmente, CAS12f não é um delas. Isto faz-lhe um desafio de tentação para bioengineers como Qi.

Nós pensamos, “aprovado, milhões de anos de evolução não pudemos transformar este sistema de CRISPR em algo esse funções no corpo humano. Podemos nós mudar aquele em apenas um ou dois anos? “Para meu conhecimento, nós, temos transformado pela primeira vez um CRISPR nonworking em um de trabalho.”

Stanley Qi, professor adjunto da universidade de BioengineeringStanford

Certamente, Xiaoshu Xu, um erudito pos-doctoral no laboratório de Qi e o autor principal do papel, não viram nenhuma actividade do Cas12f natural em pilhas humanas. Xu e Qi supor que a edição era que o ADN do genoma humano é mais complicado e menos acessível do que o ADN microbiano, fazendo o duro para que Cas12f encontre seu alvo nas pilhas. Olhando a estrutura computacionalmente prevista do sistema de Cas12f, escolheu com cuidado aproximadamente 40 mutações na proteína que poderia potencial contornear esta limitação e estabeleceu um encanamento para testar muitas variações da proteína de cada vez. Uma variação de trabalho, na teoria, giraria um verde da pilha humana ativando a proteína fluorescente verde (GFP) em seu genoma.

“No início, este sistema não trabalhou de todo por um ano,” Xu disse. “Mas após iterações da tecnologia biológica, nós vimos algumas proteínas projetadas começar girar sobre, como a mágica. Fez-nos realmente apreciar a potência da biologia e da tecnologia biológica sintéticas.”

Os primeiros resultados bem sucedidos eram modestos, mas eles Xu entusiasmado e encorajador lhe empurrar para a frente porque significou o sistema trabalhado. Sobre muitas iterações adicionais, podia melhorar mais o desempenho da proteína. “Nós começamos com ver somente duas pilhas mostrar um sinal verde, e agora após o planejamento, quase cada pilha é verde sob o microscópio,” Xu disse.

“Em algum momento, eu tive que pará-la,” Qi recordado. “Eu disse “que é bom por agora. Você fez um relativamente bom sistema. Nós devemos pensar sobre como esta molécula pode ser usada para aplicações. “”

Além do que a engenharia da proteína, os pesquisadores igualmente projectaram o RNA que guia a proteína do Cas a seu ADN do alvo. As alterações a ambos os componentes eram cruciais a fazer o trabalho do sistema de CasMINI em pilhas humanas. Testaram a capacidade de CasMINI para suprimir e editar genes nas pilhas humanas laboratório-baseadas, incluindo genes relacionou-se à infecção pelo HIV, à resposta imune antitumorosa e à anemia. Trabalhou em quase cada gene que testaram, com respostas robustas em diversos.

Abrindo a porta

Os pesquisadores têm começado já a montar colaborações com outros cientistas para levar a cabo terapias genéticas. São interessados igualmente em como poderiam contribuir aos avanços em tecnologias do RNA - como o que foi usado para desenvolver as vacinas do mRNA COVID-19 - onde o tamanho pode igualmente ser um factor de limitação.

“Esta capacidade para projectar estes sistemas foi desejada no campo desde o início de CRISPR, e eu sinto como nós fizemos nossa parte para se mover para essa realidade,” disse Qi. “E esta aproximação da engenharia pode ser tão amplamente útil. Aquele é o que me excita - abrir a porta em possibilidades novas.”

Source:
Journal reference:

Xu, X., et al. (2021) Engineered Miniature CRISPR-Cas System for Mammalian Genome Regulation and Editing. Molecular Cell. doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.008.