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Les chercheurs développent le plus petit CRISPR jusqu'à présent pour la retouche de génome

Un contrat et un système efficace de CRISPR-CAS, nommés CasMINI, pourraient être grand utiles pour le cellule-bureau d'études et les applications pour la thérapie génique parce qu'il est plus facile de livrer dans des cellules. Les découvertes apparaissent dans étude le 3 septembre publiant dans la cellule moléculaire de tourillon.

C'est un pas en avant critique pour des applications de génome-bureau d'études de CRISPR. Le travail présente le plus petit CRISPR jusqu'à présent, selon notre connaissance, comme technologie de génome-retouche. Si les gens pensent parfois à Cas9 en tant que ciseaux moléculaires, ici nous avons produit un couteau suisse contenant des fonctionnements multiples. Il n'est pas grand, mais miniature qui est hautement portatif pour l'usage facile. »

Qi de Stanley, auteur supérieur d'étude, Université de Stanford

Le développement des systèmes de CRISPR-CAS pour des cellules humaines a révolutionné le bureau d'études de génome. Ces systèmes procurent des occasions au développement des thérapies géniques pour un grand choix de maladies génétiques. Mais leurs grandes tailles limitent souvent la distribution dans des cellules et entravent ainsi des applications cliniques. Par exemple, le virus adeno-associé (AAV), un vecteur largement appliqué pour in vivo la distribution, a limité la capacité de empaquetage de la charge utile (moins kb de 4,7), et beaucoup de protéines de fusion de Cas sont au delà de cette limite. Comme résultat, il y a un besoin de concevoir les systèmes très efficaces et compacts de Cas pour faciliter le prochain rétablissement des applications de génome-bureau d'études.

Une solution potentielle est Cas12f, également connu sous le nom de Cas14. S'échelonnant entre 400 et 700 acides aminés, la protéine est moins que la moitié de la taille des systèmes actuel utilisés de CRISPR tels que Cas9 ou Cas12a. Mais jusqu'ici, il n'était pas clair si cette protéine compacte pourrait être employée en cellules mammifères. « Les années récentes ont recensé les milliers de CRISPRs, qui sont connus en tant que système de défense de l'immunité des bactéries, » Qi explique. « Plus de 99,9% de CRISPRs découvert, cependant, ne peuvent pas fonctionner en cellules humaines, limitant leur utilisation comme technologies de génome-retouche. »

Dans l'étude neuve, le Qi et sien team l'ARN appliqué et la protéine concevant au système de Cas12f pour produire d'un système efficace de Cas de miniature pour le bureau d'études mammifère de génome. Dérivé des archéobactéries, la protéine naturelle de Cas12f et son ARN d'unique-guide n'ont montré aucune activité détectable en cellules mammifères. En optimisant l'ARN d'unique-guide concevez et exécutant les ronds multiples du bureau d'études et de l'examen critique itératifs de protéine, les chercheurs ont produit d'une classe des variantes de Cas12f nommées CasMINI.

Les variantes conçues de protéine de Cas12f combinées avec l'unique-guide conçu RNAs ont montré le gène-règlement et l'activité efficaces de gène-retouche. Les chercheurs ont expliqué que CasMINI peut piloter des hauts niveaux de l'activation de gène comparables à ceux liés à Cas12a et tiennent compte de la retouche de base robuste et de la retouche de gène. D'ailleurs, il est hautement spécifique et ne produit pas des effets détectables de hors circuit-objectif.

« Ici nous tournons un CRISPR non-travaillant en cellules mammifères, par l'intermédiaire de l'ARN rationnel concevant et du bureau d'études de protéine, dans fonctionnant très efficace, » le Qi indique. « Il y avait des efforts précédents d'autres pour améliorer l'exécution de fonctionner CRISPRs. Mais notre travail est le premier pour effectuer non-travaillant fonctionnant. Ceci met en valeur le pouvoir de la bio-ingénierie de réaliser que quelque chose l'évolution n'a pas encore fait. »

La taille de la molécule conçue de CasMINI est seulement 529 acides aminés. Cette petite taille le rend adapté pour un large éventail d'applications thérapeutiques. Par exemple, les protéines de fusion de CasMINI sont bien adaptées pour l'emballage d'AAV. De plus, CasMINI ARNm peut être facilement empaqueté dans des nanoparticles de lipide ou d'autres modalités de l'ARN-distribution, améliorant potentiellement son entrée dans des cellules. Sa petite taille et source non-humaine d'agent pathogène pourraient l'effectuer moins vraisemblablement pour produire des réactions immunitaires que les grandes charges utiles de protéine seraient.

Plus de travail est nécessaire pour optimiser davantage le rendement de CasMINI pour la retouche de base et la retouche de gène et pour vérifier les performances du système in vivo avec différentes modalités de la distribution. Les chercheurs planification pour vérifier le système pour in vivo des applications pour la thérapie génique.

« La disponibilité d'un CasMINI miniature active des applications neuves, s'échelonnant des applications in vitro telles que concevoir de meilleurs lymphocytes de tumeur-massacre ou reprogrammant des cellules souche in vivo à la thérapie génique pour traiter des maladies génétiques dans l'oeil, le muscle, ou le foie, » le Qi indique. « C'est sur notre liste de souhaits que ce deviendra un traitement pour traiter des maladies génétiques, pour guérir le cancer, et pour renverser la dégénérescence d'organe. »

Source:
Journal reference:

Xu, X., et al. (2021) Engineered Miniature CRISPR-Cas System for Mammalian Genome Regulation and Editing. Molecular Cell. doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.008.