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I ricercatori sviluppano il più piccolo CRISPR fin qui per modificare del genoma

Un sistema compatto ed efficiente di CRISPR-CAS, nominato CasMINI, potrebbe essere largamente utile per le applicazioni di terapia genica e di cella-assistenza tecnica perché è più facile da consegnare nelle celle. I risultati compaiono studio in un 3 settembre di pubblicazione nella cella molecolare del giornale.

Ciò è una tappa critica in avanti per le applicazioni di genoma-assistenza tecnica di CRISPR. Il lavoro presenta il più piccolo CRISPR fin qui, secondo la nostra conoscenza, come tecnologia genoma-modificante. Se la gente a volte pensa a Cas9 come forbici molecolari, qui abbiamo creato un coltello svizzero che contiene le funzioni multiple. È non grand', ma miniatura che è altamente portatile per uso facile.„

Stanley Qi, autore senior di studio, Stanford University

Lo sviluppo dei sistemi di CRISPR-CAS per le cellule umane ha rivoluzionato l'assistenza tecnica del genoma. Questi sistemi offrono le opportunità per lo sviluppo delle terapie geniche per varie malattie genetiche. Ma le loro grandi dimensioni limitano spesso la consegna nelle celle e così impediscono le applicazioni cliniche. Per esempio, il virus adeno-associato (AAV), un vettore ampiamente fatto domanda per in vivo la consegna, ha limitato la capacità d'imballaggio del carico utile (meno di 4,7 KB) e molte proteine di fusione di Cas sono oltre questo limite. Di conseguenza, c'è una necessità di costruire i sistemi altamente efficienti e compatti di Cas per facilitare la generazione seguente di applicazioni di genoma-assistenza tecnica.

Una soluzione potenziale è Cas12f, anche conosciuto come Cas14. Variando fra 400 e 700 amminoacidi, la proteina è di meno che la metà della dimensione dei sistemi corrente usati di CRISPR quali Cas9 o Cas12a. Ma finora, non era chiaro se questa proteina compatta potrebbe essere utilizzata nelle cellule di mammiferi. “Gli anni recenti hanno identificato migliaia di CRISPRs, che sono conosciute come sistema di difesa dell'immunità dei batteri,„ Qi spiega. “Più di 99,9% di CRISPRs scoperto, tuttavia, non possono lavorare in cellule umane, limitanti il loro uso come tecnologie genoma-modificare.„

Nel nuovo studio, Qi e suo team il RNA applicato e la proteina che costruiscono al sistema di Cas12f per generare un sistema efficiente di Cas della miniatura per assistenza tecnica mammifera del genoma. Derivato dal archaea, la proteina naturale di Cas12f ed il suo RNA della unico guida non hanno mostrato attività rilevabile in cellule di mammiferi. Ottimizzando la progettazione del RNA della unico guida ed eseguendo i giri multipli di assistenza tecnica e della selezione iterative della proteina, i ricercatori hanno generato la classe A di varianti di Cas12f nominate CasMINI.

Le varianti costruite della proteina di Cas12f combinate con la unico guida costruita RNAs hanno esibito il gene-regolamento efficiente ed attività gene-modificare. I ricercatori hanno dimostrato che CasMINI può guidare gli alti livelli dell'attivazione del gene comparabili a quelli connessi con Cas12a e tiene conto la base robusta che modificano e modificare del gene. Inoltre, è altamente specifico e non produce gli effetti rilevabili dell'fuori obiettivo.

“Qui giriamo un CRISPR di lavoro in cellule di mammiferi, via assistenza tecnica razionale del RNA ed assistenza tecnica della proteina, in di lavoro altamente efficiente,„ Qi dice. “C'erano sforzi precedenti da altri per migliorare la prestazione di lavoro del CRISPRs. Ma il nostro lavoro è il primo per fare di lavoro che lavora. Ciò evidenzia la potenza della bioingegneria raggiungere che qualcosa l'evoluzione ancora non ha fatto.„

La dimensione della molecola costruita di CasMINI è soltanto 529 amminoacidi. Questo di piccola dimensione lo rende adatto a una vasta gamma di applicazioni terapeutiche. Per esempio, le proteine di fusione di CasMINI sono ben adattate per l'imballaggio di AAV. Inoltre, CasMINI mRNA può essere imballato facilmente nelle nanoparticelle del lipido o in altre modalità della RNA-consegna, potenzialmente miglioranti la sua entrata nelle celle. La sua sorgente di piccola dimensione e non umana dell'agente patogeno potrebbe farla meno probabilmente per produrre le risposte immunitarie che i grandi carichi utili della proteina sarebbero stati.

Più lavoro è necessario più ulteriormente ottimizzare il risparmio di temi di CasMINI per modificare della base e del gene che modifica e verificare la prestazione del sistema in vivo con differenti modalità della consegna. I ricercatori pianificazione verificare il sistema in vivo ad applicazioni di terapia genica.

“La disponibilità di un CasMINI miniatura permette alle nuove applicazioni, varianti dalle applicazioni in vitro come organizzazione dei linfociti migliori di tumore-uccisione o riprogrammando le cellule staminali in vivo alla terapia genica per trattare le malattie genetiche nell'occhio, nel muscolo, o nel fegato,„ Qi dice. “È sulla nostra lista di obiettivi che si trasformerà in in una terapia per trattare le malattie genetiche, per curare il cancro e per invertire la degenerazione dell'organo.„

Source:
Journal reference:

Xu, X., et al. (2021) Engineered Miniature CRISPR-Cas System for Mammalian Genome Regulation and Editing. Molecular Cell. doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.008.