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Il composto antivirale RG10 agisce via la dinamica intracellulare di SARS-CoV-2-ER

Proprio mentre le varianti emergenti del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo sfidano il potenziale di raggiungere l'immunità del gregge dalla vaccinazione, una considerevole quantità di ricerca è stata pubblicata sulla promessa delle molecole nuove che hanno il potenziale di essere efficaci contro questo virus.

Una nuova pubblicazione preliminare sul " server " del bioRxiv* descrive una piccola molecola citata come RG10 che può avere attività antivirale potente contro SARS-CoV-2 in cellule umane. A questo scopo, RG10 sembra agire interrompendo le interazioni (ER) del reticolo endoplasmatico con il virus che sono essenziali per l'infezione produttiva.

Studio: Perturbazione farmacologica della dinamica intracellulare come strategia antivirale Sars-Cov-2. Credito di immagine: Sisacorn/Shutterstock.com

Sfondo

Da quando SARS-CoV-2 in primo luogo è stato identificato come beta coronavirus novello, molti scienziati hanno messo a fuoco sull'individuazione degli interventi farmacologici efficaci per ricambiare la sue rapida ed estesa diffusione. Parecchie varianti SARS-CoV-2 di preoccupazione (VoCS) sono emerso che più alti transmissibility e/o resistenza di manifestazione a neutralizzazione dagli anticorpi suscitati dagli sforzi più iniziali di SARS-CoV-2 o dalla vaccinazione. L'emergenza di SARS-CoV-2 VoCs ha posato così una sfida negli sforzi globali per minimizzare la morbosità e la mortalità causate tramite l'infezione SARS-CoV-2.

I Antivirals quale remdesivir, che è un analogo del nucleoside che inibisce SARS-CoV-2 in vitro promuovendo la formazione di catena falsa del nucleoside, non sono riuscito a provare altamente efficace contro questo virus. L'efficacia limitata di questi composti è stata associata con entrambi loro effetti secondari significativi e la necessità amministrarli per via endovenosa.

Altri agenti ad azione diretta (DAA) che inibiscono l'enzima virale della polimerasi sono risultato essere inaffidabili per controllo a lungo termine. Ciò perché i virus dell'acido ribonucleico (RNA) come SARS-CoV-2 cambiano tipicamente il loro modo di associazione via le mutazioni regolari, così sta permettendo che il virus sfuggisse a tale inibizione. Ciò ha sollevato l'esigenza dell'host-ottimizzazione degli agenti (HTA) pure.

Obiettivo di HTAs le cellule ospiti che promuovono la replicazione virale e la propagazione. Di conseguenza, questo è l'approccio preferito una volta combinato con la vaccinazione ed il DAA.  

I vantaggi di avere un'ampia varietà di antivirals sono che le droghe repurposed non possono fungere sempre da aggettanti, o possono avere bisogno di di essere ottimizzato per attività antivirale più efficiente. Alternativamente, gli effetti secondari di determinati antivirals possono essere inaccettabili al livello della popolazione. In terzo luogo, possono essere sfuggiti a facilmente dalle mutazioni.

Per concludere, facendo uso di un cocktail delle droghe è sempre utile nell'elevazione del risparmio di temi della droga.

SARS-CoV-2 soprattutto utilizza il ricevitore dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2 della cellula ospite (ACE2) per guadagnare l'entrata nell'organismo. Tuttavia, questo virus egualmente a volte richiede la proteasi TMPRSS2 della serina del transmembrane per l'entrata delle cellule, a meno che le celle mostrino l'acidificazione endosomal. Qualsiasi modo, SARS-CoV-2 registra la cella via un meccanismo clathrin-mediato quel infine provoca la fusione del virus con la membrana cellulare.

Successivamente, il genoma virale del RNA, protetto dalla nucleoproteina, fornisce il ER per la traduzione di proteine e di replicazione virale virali.

Risultati di studio

Lo studio corrente messo a fuoco su una molecola ha chiamato RG10, che è un composto derivato sulfamoyl-fenilico con attività antivirale equivalente a quella di remdesivir. Questa piccola molecola novella non era tossica alla cella, ma ha avuta un'efficace concentrazione mezzo massima (EC50) di circa 1,5 micromolar (μM).

RG10 ha mostrato l'attività antivirale eccellente contro SARS-CoV-2 in vitro, quasi abolendo l'infezione delle celle che precedentemente sono state esposte a questo virus. Più ulteriormente, RG10 è stato trovato per mostrare l'attività inibitoria soltanto una volta aggiunto dopo l'entrata virale, quindi indicante che il suo meccanismo di atto è sopprimendo la replicazione virale, piuttosto che l'entrata virale.

Gli scienziati hanno osservato che la molecola fluorescente-contrassegnata RG10 è stata ragruppata nel ER, con i complessi della replica del virus, sebbene entrambe fossero nelle regioni separate. Ciò significa che RG10 è probabile un HTA.

(A-B) le celle di Vero E6 sono state curate con i derivati indicati o Remdesivir di RG alle concentrazioni indicate e successivamente sono state infettate con SARS-CoV-2 al MOI 0,01 per 48 h in presenza dei composti. (A) I livelli relativi del RNA SARS-CoV-2 (vRNA) di manifestazioni del grafico hanno misurato dal RT-qPCR e normalizzato dall'espressione del RNA Rpl27. Le barre sono mezzi +/- deviazione standard da un rappresentante dei duplicati di due esperimenti indipendenti. La t-prova dello studente ** valore di P < 0,01; valore del *** P < 0,005; valore del **** P < 0,001. (B) La citotossicità misurata dall'analisi della versione di LDH non ha evidenziato differenze significative fra i composti. (C) celle di Vero E6 sono stati trattati con RG10 alle varie concentrazioni e successivamente sono stati infettati ed elaborato stati come nel A. IC50 era µM 1,55 +/- 0,11 come misurato da tre esperimenti indipendenti. (D) le celle E6 (celle del rene della scimmia), Caco2 (celle intestinali umane) o Huh7.5.1 (celle di Vero di fegato umane), sono state curate con 10 µM RG10 e successivamente sono state infettate con CoV2 al MOI 0,01 per 48 h in presenza dei composti. I livelli relativi del RNA CoV2 (vRNA) di manifestazioni del grafico hanno misurato dal RT-qPCR e normalizzato dall'espressione del RNA Rpl27. Le barre sono mezzi +/- deviazione standard da un rappresentante dei duplicati di due esperimenti indipendenti. La t-prova dello studente ** valore di P < 0,01; valore del *** P < 0,005; valore del **** P < 0,001. (E) le celle di Huh7.5.1 sono state curate con 10 µM RG10 o 10 µM Remdesivir e successivamente sono state infettate con CoV2 al MOI indicato per 48 H. Il grafico mostra i livelli relativi del vRNA misurati dal RT-qPCR e normalizzati dall'espressione del RNA Rpl27. Le barre sono mezzi +/- deviazione standard da un rappresentante dei duplicati di due esperimenti indipendenti. La t-prova dello studente * valore di P < 0,05 e valore del **** P < 0,001. (F) le celle di Huh7.5.1 sono state curate con 10 µM RG10 o 10 il µM Remdesivir e successivamente infettato con SARS-CoV-2 al MOI 0,5 per 48 celle del H. poi era infezione fatta l'elettrolisi del paletto di 48 h. I lysates sono stati elaborati per macchiare occidentale facendo uso di anti anticorpo della punta SARS-CoV-2 e di un anticorpo anti--GAPDH come controllo di caricamento. Entrambi i immunostainings sono stati rivelati facendo uso degli anticorpi secondari coppia a HRP. (G) le celle sono state infettate come nella F quindi sono state fissate e macchiato state facendo uso di anti anticorpo di SARS-CoV-2 Nucleocapsid e di un anticorpo J2 che riconoscono il rappresentante a doppia elica del RNA (dsRNA) dei complessi della replicazione virale. I micrografi mostrano i diversi canali che si sono acquistati facendo uso di un microscopio confocale e sono stati elaborati facendo uso di ImageJ. (H) i campioni sono stati trattati come in F e celle era l'infezione distaccata e fissa del paletto di 48 h. I campioni sono stati macchiati ed analizzato stati da citometria a flusso. La t-prova dello studente * valore di P < 0,05.

L'attività antivirale di RG10 completamente non è spiegato stata tramite l'induzione dello sforzo sul ER. Invece, questo composto ha rallentato il movimento del virus al ER per la replica e la traduzione. Cioè la dinamica intracellulare della cella infettata è perturbata da RG10, impedente il suo trasporto regolare al ER.

RG10 non ha pregiudicato l'infezione virale di Zika, che fosse a differenza del tunicamycin della molecola, che induce lo sforzo di ER ed ha pregiudicato sia SARS-CoV-2 che RG10 ugualmente. RG10 ha mostrato l'attività contro il coronavirus umano 229E, comunque con la potenza più bassa.

RG10 egualmente ha mostrato l'efficacia antivirale ex vivo in celle epiteliali della galleria di ventilazione umana, come dimostrato dalla sua capacità di diminuire l'infezione virale e la traduzione virale della proteina. In questo modello, lo sforzo di ER è stato indotto da RG10 e la rete citoscheletrica dell'actina è sembrato mostrare la riorganizzazione sul lato apicale della cella.

La stabilità della molecola RG10 è bassa, rappresentando la sua potenza antivirale bassa, che piombo allo sviluppo di un derivato chiamato RG10b. Questa molecola stabile ha mostrato un EC50 di meno di 1 μM, con un'emivita più triplo più su confrontato alla molecola del genitore.

La potenza di RG10b era egualmente superiore a quella di RG10. A questo scopo, ex vivo la sfida con SARS-CoV-2 seguito dal trattamento con RG10b ha dimostrato una potenza equivalente a quella di remdesivir.

Implicazioni

I risultati di questo studio dimostrano un inibitore potenzialmente utile di vasto-spettro di movimento SARS-CoV-2 al ER. Di conseguenza, RG10b sembra inibire sia la replicazione virale che la traduzione virale della proteina, tutto l'attimo che mantiene l'alta stabilità in vivo senza indurre alcuni effetti tossici a sorgere nelle cellule di cultura.

L'obiettivo esatto di RG10 rimane sconosciuto; tuttavia, perturba SARS-CoV-2 e la dinamica di ER, così interrompendo il traffico intracellulare. Il citoscheletro dell'actina egualmente sembra diventare disordinato in parte in celle primarie di HAE dopo l'esposizione a RG10. Tuttavia, a differenza dell'altra actina disruptori gradiscono Latrunculin, jasplakinolide e il cytocalasin la D, RG10b non mostra la citotossicità significativa.

Il cambiamento nella morfologia di ER che segue l'esposizione RG10 era un'altra individuazione. Questo cambiamento nella morfologia può contribuire ai sui effetti antivirali.

Il ER deve essere rimodellato costantemente per compiere l'intervallo delle funzioni sostiene, così permettendo che le membrane di ER siano un obiettivo principale per gli agenti patogeni. Di conseguenza, una variazione dinamica nella morfologia di ER ha potuto essere una strategia che antivirale; tuttavia, ulteriore ricerca è necessaria confermare questo meccanismo.

Atlastins è classe A di composti che egualmente pregiudicano il ER. Infatti, la replica del virus di Zika è diminuita dalle anomalie nella forma di ER mediata dai atlastins. Il ruolo ha giocato dai atlastins nell'infezione SARS-CoV-2, all'occorrenza, non è stato studiato finora.

I ricercatori dello studio corrente egualmente hanno aggiunto alla schiera dei nuovi strumenti per studiare come SARS-CoV-2 pregiudica la cella infettata. Il loro uso delle particelle luminose SARS-CoV-2 che rimangono contagiose come il virus selvaggio tipo potrebbe essere imitato in molte analisi differenti per capire i modi diversi in cui questo virus registra la cellula ospite.

avviso *Important

il medRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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