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O composto antiviroso RG10 actua através da dinâmica intracelular de SARS-CoV-2-ER

Mesmo enquanto as variações emergentes do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) desafiam o potencial conseguir a imunidade do rebanho pela vacinação, uma quantidade considerável de pesquisa estêve publicada em prometer as moléculas novas que têm o potencial ser eficazes contra este vírus.

Uma pré-impressão nova no server do bioRxiv* descreve uma molécula pequena referida como RG10 que pode ter a actividade antivirosa poderoso contra SARS-CoV-2 em pilhas humanas. Com tal fim, RG10 parece actuar interrompendo as interacções do segundo estômago (ER) endoplasmic com o vírus que são essenciais para a infecção produtiva.

Estudo: Perturbação farmacológica da dinâmica intracelular como uma estratégia do antiviral Sars-Cov-2. Crédito de imagem: Sisacorn/Shutterstock.com

Fundo

Desde que SARS-CoV-2 foi identificado primeiramente como um beta coronavirus novo, muitos cientistas centraram-se sobre encontrar intervenções farmacológicas eficazes para opr sua propagação rápida e extensiva. Diversas variações SARS-CoV-2 do interesse (VoCS) emergiram que um transmissibility e/ou uma resistência mais altos da mostra à neutralização pelos anticorpos induzidos pelas tensões mais adiantadas de SARS-CoV-2 ou pela vacinação. A emergência de SARS-CoV-2 VoCs levantou assim um desafio em esforços globais para minimizar a morbosidade e a mortalidade causadas pela infecção SARS-CoV-2.

Os antivirais tais como o remdesivir, que é um analog do nucleoside que iniba SARS-CoV-2 in vitro promovendo a formação de uma corrente falsa do nucleoside, não provaram altamente eficaz contra este vírus. A eficácia limitada destes compostos foi associada com ambos seus efeitos secundários significativos e a necessidade administrá-los intravenosa.

Outros agentes a acção directa (DAA) que inibem a enzima viral da polimerase provaram ser incertos para o controle a longo prazo. Isto porque os vírus do ácido ribonucléico (RNA) como SARS-CoV-2 mudam tipicamente seu modo de ligação através das mutações regulares, está permitindo assim que o vírus escapasse tal inibição. Isto levantou a necessidade para anfitrião-visar agentes (HTA) também.

Alvo de HTAs as pilhas de anfitrião que promovem a réplica viral e a propagação. Conseqüentemente, esta é a aproximação preferida quando combinada com a vacinação e o DAA.  

As vantagens de ter uma grande variedade de antivirais são que as drogas repurposed não podem sempre actuar como projetadas, ou podem precisar de ser aperfeiçoado para uma actividade antivirosa mais eficiente. Alternativamente, os efeitos secundários de determinados antivirais podem ser inaceitáveis a nível da população. Em terceiro lugar, podem facilmente ser escapados por mutações.

Finalmente, usar um cocktail das drogas é sempre útil em maximizar a eficiência da droga.

SARS-CoV-2 usa primeiramente o receptor deconversão da enzima 2 da pilha de anfitrião (ACE2) para ganhar a entrada no corpo. Contudo, este vírus igualmente exige às vezes o protease TMPRSS2 do serine da transmembrana para a entrada da pilha, a menos que as pilhas mostrarem a acidificação endosomal. De qualquer maneira, SARS-CoV-2 incorpora a pilha através de um mecanismo clathrin-negociado esse conduz finalmente à fusão do vírus com a membrana de pilha.

Subseqüentemente, o genoma viral do RNA, protegido pelo nucleoprotein, incorpora o ER para a tradução de proteínas virais e de réplica viral.

Resultados do estudo

O estudo actual focalizado em uma molécula chamou RG10, que é um composto derivado sulfamoyl-phenyl com a actividade antivirosa equivalente àquela do remdesivir. Esta molécula pequena nova não era tóxica à pilha, mas tinha uma concentração eficaz metade-máxima (EC50) de aproximadamente 1,5 micromolar (μM).

RG10 mostrou a actividade antivirosa excelente contra SARS-CoV-2 in vitro, quase abulindo a infecção das pilhas que foram expor previamente a este vírus. Mais, RG10 foi para mostrado a actividade inibitório somente quando adicionado após a entrada viral, indicando desse modo que seu mecanismo da acção é suprimindo a réplica viral, um pouco do que a entrada viral.

Os cientistas observaram que a molécula RG10 fluorescente-etiquetada estêve aglomerada no ER, junto com os complexos da réplica do vírus, embora ambos estavam em regiões separadas. Isto significa que RG10 é provável um HTA.

(A-B) as pilhas de Vero E6 foram tratadas com os derivados indicados ou o Remdesivir de RG em concentrações indicadas e contaminadas subseqüentemente com o SARS-CoV-2 em MOI 0,01 para 48 h na presença dos compostos. (a) Os níveis relativos do RNA SARS-CoV-2 das mostras do gráfico (vRNA) mediram pelo RT-qPCR e normalizado pela expressão do RNA Rpl27. As barras são meios +/- SD de um representante das duplicatas de duas experiências independentes. O t-teste do estudante ** valor de p < 0,01; valor do *** p < 0,005; valor do **** p < 0,001. (B) A citotoxidade medida pelo ensaio da liberação de LDH não mostrou nenhuma diferença significativa entre os compostos. (c) As pilhas de Vero E6 foram tratadas com o RG10 em várias concentrações e contaminadas subseqüentemente e processadas como no A. O IC50 era o µM 1,55 +/- 0,11 como medido de três experiências independentes. (d) As pilhas E6 (pilhas do rim do macaco), Caco2 (pilhas intestinais humanas) ou Huh7.5.1 de Vero (pilhas de fígado humanas), foram tratadas com 10 o µM RG10 e contaminadas subseqüentemente com o CoV2 em MOI 0,01 para 48 h na presença dos compostos. Os níveis relativos do RNA CoV2 das mostras do gráfico (vRNA) mediram pelo RT-qPCR e normalizado pela expressão do RNA Rpl27. As barras são meios +/- SD de um representante das duplicatas de duas experiências independentes. O t-teste do estudante ** valor de p < 0,01; valor do *** p < 0,005; valor do **** p < 0,001. (e) As pilhas Huh7.5.1 foram tratadas com 10 o µM RG10 ou 10 o µM Remdesivir e contaminadas subseqüentemente com o CoV2 no MOI indicado para 48 H. Os níveis relativos do vRNA das mostras do gráfico mediram pelo RT-qPCR e normalizado pela expressão do RNA Rpl27. As barras são meios +/- SD de um representante das duplicatas de duas experiências independentes. O t-teste do estudante * valor de p < 0,05 e valor do **** p < 0,001. (f) As pilhas Huh7.5.1 foram tratadas com 10 o µM RG10 ou 10 o µM Remdesivir e contaminado subseqüentemente com o SARS-CoV-2 em MOI 0,5 para 48 pilhas do H. era então infecção lysed do cargo de 48 h. Os lysates foram processados para a mancha ocidental usando um anti anticorpo do ponto SARS-CoV-2 e um anti-GAPDH anticorpo como o controle de carga. Ambos os immunostainings foram revelados usando os anticorpos secundários acoplados a HRP. (g) As pilhas foram contaminadas como em F a seguir fixado e manchado usar um anti anticorpo de SARS-CoV-2 Nucleocapsid e um anticorpo J2 que reconhecem o dobro encalhou o representante do RNA (dsRNA) de complexos virais da réplica. As micrografia mostram os canais individuais que foram adquiridos usando um microscópio confocal e processados usando ImageJ. (h) As amostras foram tratadas como em F e em pilhas estava a infecção destacada e fixa do cargo de 48 h. As amostras foram manchadas e analisadas pelo cytometry de fluxo. O t-teste do estudante * valor de p < 0,05.

A actividade antivirosa de RG10 não foi explicada completamente pela indução do esforço no ER. Em lugar de, este composto retardou o movimento do vírus ao ER para a réplica e a tradução. Isto é, a dinâmica intracelular da pilha contaminada é molestada por RG10, impedindo seu transporte liso ao ER.

RG10 não afectou a infecção do vírus de Zika, que é ao contrário do tunicamycin da molécula, que induz o esforço do ER e afectou SARS-CoV-2 e RG10 ingualmente. RG10 mostrou a actividade contra o coronavirus humano 229E, embora com mais baixa potência.

RG10 igualmente mostrou a eficácia antivirosa ex vivo em pilhas epiteliais da via aérea humana, como demonstrado por sua capacidade para reduzir a infecção viral e a tradução viral da proteína. Neste modelo, o esforço do ER foi induzido por RG10, e a rede cytoskeletal do actínio pareceu mostrar o rearranjo no lado apical da pilha.

A estabilidade da molécula RG10 é baixa, esclarecendo sua baixa potência antivirosa, que conduziu à revelação de um derivado chamado RG10b. Esta molécula estável mostrou um EC50 de menos de 1 μM, com uma meia-vida mais do que a três-dobra comparada mais altamente à molécula do pai.

A potência de RG10b era igualmente mais alta do que aquela de RG10. Com tal fim, ex vivo o desafio com o SARS-CoV-2 seguido pelo tratamento com o RG10b demonstrou uma potência equivalente àquela do remdesivir.

Implicações

Os resultados deste estudo demonstram um inibidor potencialmente útil do largo-espectro do movimento SARS-CoV-2 ao ER. Em conseqüência, RG10b parece inibir a réplica viral e a tradução viral da proteína, o tempo todo mantendo a estabilidade alta in vivo sem fazer com que todos os efeitos tóxicos elevarem nas pilhas de cultura.

O alvo exacto de RG10 permanece desconhecido; contudo, molesta SARS-CoV-2 e dinâmica do ER, assim interrompendo o tráfico intracelular. O cytoskeleton do actínio igualmente parece tornar-se em certa medida desordenado em pilhas preliminares de HAE após a exposição a RG10. Contudo, ao contrário do outro actínio os disruptors gostam de Latrunculin, jasplakinolide, e o cytocalasin D, RG10b não mostra a citotoxidade significativa.

A mudança na morfologia do ER que segue a exposição RG10 era outro encontrar. Esta mudança na morfologia pode contribuir a seus efeitos antivirosos.

O ER precisa de ser remodelado constantemente a fim cumprir a escala das funções que sustenta, assim permitindo que as membranas do ER sejam um alvo principal para os micróbios patogénicos. Conseqüentemente, uma SHIFT dinâmica na morfologia do ER podia ser uma estratégia antivirosa; contudo, uma pesquisa mais adicional é necessário confirmar este mecanismo.

Atlastins é uma classe de compostos que igualmente afectam o ER. De facto, a réplica do vírus de Zika é reduzida por anomalias na forma do ER negociada por atlastins. O papel jogado por atlastins na infecção SARS-CoV-2, eventualmente, não tem sido estudado até agora.

Os pesquisadores do estudo actual igualmente adicionaram à disposição de novas ferramentas para estudar como SARS-CoV-2 afecta a pilha contaminada. Seu uso das partículas SARS-CoV-2 brilhantes que permanecem tão infecciosas como o selvagem-tipo vírus poderia ser imitado em muitos ensaios diferentes para compreender as maneiras diferentes a que este vírus incorpora a pilha de anfitrião.

observação *Important

o medRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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