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représentation de Superbe-définition et analyse granulométrique des particules du virus SARS-CoV-2

Malheureusement, nous nous sommes familiarisés avec le fardeau des maladies virales au cours des deux dernières années, avec la maladie 2019 (COVID-19) de coronavirus prétendant les durées des millions de gens mondiaux.

Quoique la grippe ne soit pas habituellement dans les titres, il n'est pas rare que les manifestations du virus donnent droit dans plus de 650.000 morts par an - ou même plus quand des épidémies non-annuelles irrégulières sont tenues compte.

Il est courant pour des virus de la même substance pour montrer des différences important dans la taille et forme - pleomorphism. Par exemple, dans la grippe, des particules virales peuvent être vues en tant que n'importe quoi des sphères 100nm de diamètre longtemps, les filaments tendus qui peuvent atteindre plusieurs microns à travers.

D'autres virus connus pour montrer le pleomorphism comprennent Ebola, la rougeole, et le virus de la maladie de Newcastle. Malheureusement, ce pleomorphism est mal compris et présente un barrage à comprendre davantage la structure et la morphologie des virus.

Maintenant, les chercheurs de l'université d'Oxford et l'université de Warwick ont collaboré pour développer une méthode mieux pour comprendre et évaluer ces pleiomorphisms. Le travail des chercheurs est actuellement disponible sur le serveur de prétirage de bioRxiv* tout en attendant l'inspection professionnelle.

Les particules de grippe tendent à façonner en une de trois formes - sphères de autour de bacilliforme du diamètre 120nm, ellipsoïde, capsulaire, ou parharicot formée autour de 120-250nm de diamètre, ou des filaments au-dessus de 250nm dans la longueur. Celles-ci sont entourées par les bilayers de lipide qui contiennent les pointes extérieures incluses de protéine, environ 375 au total. Ce sont en grande partie hemagglutinin (HA), mais approximativement un septième sont neuraminidase (NA). Les pointes de Na tendent à former des boîtiers, souvent à l'extrême inverse du pôle au génome viral. Sous cette couche extérieure se trouve une modification des protéines de structure, et sous le ce des mensonges le génome. La majeure partie de ces informations a été recueillie par la microscopie électronique - la microscopie à fluorescence n'a pas habituellement la définition de trouver la plupart des virus, effectuant le visionnement détaillé de différentes particules près d'impossible.

Représentation élevée de débit de la grippe utilisant le schéma de la microscopie de superbe-définition A) du protocole de marquage. Des échantillons de virus ont été séchés directement sur les lamelles en verre enduites avec de la poly-L-lysine avant d
Représentation élevée de débit de la grippe utilisant le schéma de la microscopie de superbe-définition A) du protocole de marquage. Des échantillons de virus ont été séchés directement sur les lamelles en verre enduites avec de la poly-L-lysine avant d'être fixes, permeabilized d'un préenduisage et souillées avec des anticorps utilisant un protocole normal d'immunofluorescence. B) Un champ de vision représentatif (FOV) d'une image de widefield de la grippe A/Udorn/72 marquée, imagée dans la glissière verte. Μm de la barre 10 d'écaille. C) Un champ de vision de préposé du service d'une image de widefield d'un échantillon négatif de virus, imagée dans la glissière verte. Μm de la barre 10 d'écaille. D) L'image correspondante de dSTORM du champ de vision en B), où l'ha est marqué en vert et Na est marquée en rouge. Μm de la barre 10 d'écaille. PAR EXEMPLE) dedans changées de plan images D) de montrer différents filaments et particules sphériques. Μm de la barre 5 d'écaille.

Malheureusement, la microscopie électronique est chère et lente. Les chercheurs ont produit une technique pour introduire la représentation de haut-débit des virions filamenteux en combinant la microscopie optique stochastique directe de reconstruction (dSTORM) - une méthode avec une définition de 20nm de dessous - et le logiciel d'analyse robotisé rapide pour permettre à des milliers de virions d'être recensé et s'analysé en même temps.

Les scientifiques se sont concentrés sur une tension déjà bien-caractérisée de la grippe A/Udorn/72 de grippe, qui manifeste des phénotypes sphériques et filamenteux.

En enduisant la glace de franchement - poly-L-lysine ou chitosan linéaire chargée de polymères, ils pouvaient immobiliser des particules de virus sur les guides. Des particules de virus ont été séchées directement sur des lamelles enduites de la poly-L-lysine et imagées elles utilisant un microscope de fluorescence de réflexion interne de total de widefield. Des bâtis de dix-millièmes d'un champ de vision unique (FOV) ont été pris pour produire d'une image haute résolution d'un grand nombre de particules sphériques et de filament de différentes longueurs. Ces images ont montré une population apparemment faite au hasard des particules de filament avec des degrés remarquables de variabilité, s'échelonnant entre 250nm à plusieurs microns longs. Quelques filaments viraux étaient plus grands que les images utilisées et exigées de limite de diffraction de large-inducteur avec les signes diffraction-limités.

Le virus a été marqué avec de l'anticorps anti-HA qui a permis à un pipeline robotisé rapide d'analyse de mesurer la longueur de ces filaments.

Après réglage des images et exclusion de toutes les particules plus petites que 234nm (car ceux-ci seraient en dessous de la limite de diffraction), les chercheurs avaient l'habitude le logiciel pour combler les lacunes des particules de virus d'endroits non marqués, et ont pris la forme la plus simple possible.

On a assumé que les longueurs de ces formes sont les longueurs des particules de virus. Presque 500 différents champs de vision étaient imagés, et plus de 46.000 particules filamenteuses ont été mesurés.

L'analyse a indiqué l'immense majorité de filaments étaient sous 1000nm longtemps. Ceci est supporté par des études précédentes montrant un risque accru des filaments se brisant à de plus longues longueurs. le dSTORM et un algorithme de groupement de DBSCAN ont été employés pour analyser de plus petites molécules, et l'organisme de protéine de surface a été vérifié par l'analyse d'intensité et Fourier transforme.

représentation de Superbe-définition et analyse granulométrique des particules du virus SARS-CoV-2. A) Une image représentative de superbe-définition des virions SARS-CoV-2 double-marqués avec des anticorps primaires d
représentation de Superbe-définition et analyse granulométrique des particules du virus SARS-CoV-2. A) Une image représentative de superbe-définition des virions SARS-CoV-2 double-marqués avec des anticorps primaires d'anti-pointe et d'anti-nucléoprotéine (n) et les anticorps secondaires marqués avec Alexa647 (rouge) et Alexa546 (vert) respectivement. Μm de la barre 10 d'écaille. B&C) a changé de plan des images des différentes particules SARS-CoV-2 (mises en valeur dans les boîtiers blancs en A). Barre 100 nanomètre d'écaille. D) des localisations de Superbe-définition dans la glissière verte (marquant la protéine de N) ont été groupées et chaque boîtier ont été équipées d'une ellipse pour extraire des cotes de particules. Un histogramme des longueurs d'axe principal équipées d'un fonctionnement gaussien prouve que les virions tombent dans une population unique, centrée à 143.8nm. E) L'histogramme du rapport axe principal/moins important montre une distribution unique.

Les scientifiques mettent en valeur l'utilisation que les techniques mentionnées ci-dessus ont en analysant des particules virales rapidement et en masse tout en mettant à jour une haute résolution. Pour montrer davantage l'installation de leur méthode, ils ont rapidement analysé le virus déjà-bien-caractérisé du coronavirus 2 de syndrôme respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) à l'effet significatif. Cette méthode a pu être inestimable dans l'assistance avec le travail urgent tel que la purification de virus en recensant le nombre de virions filamenteux ou en recensant rapidement la taille et la morphologie afin d'accélérer la production vaccinique.

avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée

Journal reference:
Sam Hancock

Written by

Sam Hancock

Sam completed his MSci in Genetics at the University of Nottingham in 2019, fuelled initially by an interest in genetic ageing. As part of his degree, he also investigated the role of rnh genes in originless replication in archaea.

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