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rappresentazione di Super-risoluzione ed analisi granulometrica delle particelle del virus SARS-CoV-2

Purtroppo, abbiamo acquisito dimestichezza con il carico delle malattie virali in questi ultimi due anni, con la malattia 2019 (COVID-19) di coronavirus che reclama le durate di milioni di persone universalmente.

Anche se l'influenza non è solitamente nei titoli, per gli scoppi non è raro del virus risultare dentro oltre 650.000 morti all'anno - o persino più quando le epidemie non annuali irregolari sono considerate.

È comune per i virus delle stesse specie evidenziare le differenze significative nella forma e nella dimensione - pleomorphism. Per esempio, nell'influenza, le particelle virali possono essere vedute lungamente come qualche cosa dalle sfere 100nm di diametro, filamenti stesi che possono raggiungere parecchi micron attraverso.

Altri virus conosciuti per esibire il pleomorphism includono Ebola, il morbillo ed il virus di malattia di Newcastle. Purtroppo, questo pleomorphism è capito male e presenta una barriera più ulteriormente a capire la struttura e la morfologia dei virus.

Ora, i ricercatori dall'università di Oxford e l'università di Warwick hanno collaborato per mettere a punto un metodo per capire e valutare meglio questi pleiomorphisms. Il lavoro dei ricercatori è attualmente disponibile sul " server " della pubblicazione preliminare del bioRxiv* mentre attende la revisione tra pari.

Le particelle di influenza tendono a formarsi in una di tre forme - sfere intorno di bacilliforme ellissoidale, capsulare, o il rene-fagiolo a forma di del diametro 120nm, intorno a 120-250nm di diametro, o filamenti sopra 250nm di lunghezza. Questi sono circondati dai doppii strati lipidici che contengono le punte di superficie incluse della proteina, intorno 375 nel totale. Questi sono principalmente hemagglutinin (HA), ma circa un settimo è neuraminidasi (NA). Le punte del Na tendono a formare i cluster, spesso all'estremo opposto del palo al genoma virale. Sotto questo strato superficiale si trova una matrice delle proteine strutturali e sotto il questo bugie il genoma. La maggior parte di questi informazioni è stata riunita con microscopia elettronica - la microscopia di fluorescenza non ha solitamente la risoluzione individuare la maggior parte dei virus, facenti la visualizzazione dettagliata di diverse particelle vicino ad impossibile.

Alta rappresentazione di capacità di lavorazione di influenza facendo uso del disegno schematico di microscopia A di super-risoluzione) del protocollo di contrassegno. I campioni del virus sono stati asciugati direttamente sulle lamelle di vetro ricoperte prima con poli-L-lisina prima di essere fissi, permeabilised e macchiate con gli anticorpi facendo uso di un protocollo standard dell
Alta rappresentazione di capacità di lavorazione di influenza facendo uso del disegno schematico di microscopia A di super-risoluzione) del protocollo di contrassegno. I campioni del virus sono stati asciugati direttamente sulle lamelle di vetro ricoperte prima con poli-L-lisina prima di essere fissi, permeabilized e macchiate con gli anticorpi facendo uso di un protocollo standard dell'immunofluorescenza. B) Un campo visivo rappresentativo (FOV) di un'immagine del widefield di influenza contrassegnata A/Udorn/72, imaged nel canale verde. Μm della barra 10 del disgaggio. C) Un FOV del rappresentante di un'immagine del widefield di un campione negativo del virus, imaged nel canale verde. Μm della barra 10 del disgaggio. D) L'immagine corrispondente del dSTORM del FOV da B), dove l'ha è contrassegnato in verde e Na è contrassegnata nel rosso. Μm della barra 10 del disgaggio. PER ESEMPIO) immagini zummate D) dalla mostra i filamenti diversi e delle particelle sferiche. Μm della barra 5 del disgaggio.

Purtroppo, la microscopia elettronica è costosa e lenta. I ricercatori hanno creato una tecnica per promuovere la rappresentazione di alto-capacità di lavorazione dei virions filamentosi combinando la microscopia ottica stocastica diretta di ricostruzione (dSTORM) - un metodo con una risoluzione di 20nm di sotto - ed il software di analisi automatizzato rapida per permettere che migliaia di virions siano identificate ed analizzate allo stesso tempo.

Gli scienziati hanno messo a fuoco su uno sforzo già ben-caratterizzato di influenza A/Udorn/72 della riossidazione, che video sia i fenotipi sferici che filamentosi.

Ricoprendo il vetro di positivamente - poli-L-lisina o chitosan lineare fatta pagare dei polimeri, potevano vincolare le particelle del virus sulle diapositive. Le particelle del virus sono state asciugate direttamente sulle lamelle ricoperte di poli-L-lisina ed imaged loro facendo uso di un microscopio di fluorescenza del riflesso interno di totale del widefield. I fotogrammi di diecimila di singolo campo visivo (FOV) sono stati catturati per generare un'immagine ad alta definizione di tantissime sia particelle del filamento che sferiche delle lunghezze differenti. Queste immagini hanno mostrato una popolazione apparentemente casuale delle particelle del filamento con i gradi notevoli di variabilità, varianti fra 250nm a parecchi micron di lunghezza. Alcuni filamenti virali erano più grandi delle immagini usate e richieste di limite di diffrazione del ampio-campo con i segnali diffrazione-limitati.

Il virus è stato contrassegnato con un anticorpo anti-HA che ha permesso che una conduttura dell'analisi automatizzata rapida misurasse la lunghezza di questi filamenti.

Dopo la regolazione delle immagini e l'esclusione delle qualsiasi particelle più piccole di 234nm (poichè questi sarebbero stati sotto il limite di diffrazione), i ricercatori hanno usato il software per colmare dentro le lacune delle particelle del virus di aree non contrassegnate ed hanno catturato la forma più semplice possibile.

Le lunghezze di queste forme sono state presupposte per essere le lunghezze delle particelle del virus. Quasi 500 diversi FOVs erano imaged ed oltre 46.000 particelle filamentose sono stati misurati.

L'analisi ha rivelato la vasta maggioranza dei filamenti era sotto 1000nm lungamente. Ciò è supportata dagli studi precedenti che mostrano un rischio aumentato di filamenti che si rompono alle lunghezze più lunghe. il dSTORM e un algoritmo di raggruppamento di DBSCAN sono stati usati per analizzare le più piccole molecole e l'organizzazione della proteina della superficie è stata studiata con l'analisi dell'intensità e Fourier trasforma.

rappresentazione di Super-risoluzione ed analisi granulometrica delle particelle del virus SARS-CoV-2. A) Un
rappresentazione di Super-risoluzione ed analisi granulometrica delle particelle del virus SARS-CoV-2. A) Un'immagine rappresentativa di super-risoluzione dei virions SARS-CoV-2 doppio-contrassegnata con gli anticorpi primari della anti-nucleoproteina e della anti-punta (n) e gli anticorpi secondari contrassegnati rispettivamente con Alexa647 (rosso) e Alexa546 (verde). Μm della barra 10 del disgaggio. B&C) ha zumato immagini di diverse particelle SARS-CoV-2 (evidenziate nelle caselle bianche in A). Barra 100 nanometro del disgaggio. D) le localizzazioni di Super-risoluzione nel canale verde (che contrassegna la proteina di N) sono state ragruppate ed ogni cluster misura con un ellisse per estrarre le dimensioni della particella. Un istogramma delle lunghezze di asse principale misura con una funzione gaussiana indica che i virions cadono in una singola popolazione, concentrata a 143.8nm. E) L'istogramma del rapporto di maggiore/asse minore mostra una singola distribuzione.

Gli scienziati evidenziano l'uso che le tecniche suddette hanno nell'analizzare le particelle virali rapidamente ed in blocco mentre mantengono un'alta risoluzione. Per più ulteriormente mostrare l'utilità del loro metodo, hanno analizzato rapido il virus già-bene-caratterizzato di coronavirus 2 di sindrome respiratorio acuto severo (SARS-CoV-2) ad effetto significativo. Questo metodo ha potuto essere inestimabile nell'assistenza al lavoro urgente quale depurazione del virus identificando il numero dei virions filamentosi o rapidamente identificando la dimensione e la morfologia per accelerare la produzione vaccino.

avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite

Journal reference:
Sam Hancock

Written by

Sam Hancock

Sam completed his MSci in Genetics at the University of Nottingham in 2019, fuelled initially by an interest in genetic ageing. As part of his degree, he also investigated the role of rnh genes in originless replication in archaea.

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