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imagem lactente da Super-definição e análise de tamanho de partículas do vírus SARS-CoV-2

Infelizmente, nós tornamo-nos familiares com a carga de doenças virais sobre os dois anos passados, com a doença 2019 do coronavirus (COVID-19) que reivindica as vidas de milhões de povos no mundo inteiro.

Mesmo que a gripe não esteja geralmente nos título, não é raro para manifestações do vírus resultar dentro sobre 650.000 mortes pelo ano - ou mesmo mais quando as epidemias não-anuais irregulares são levadas em consideração.

É comum para vírus da mesma espécie mostrar diferenças significativas na forma e no tamanho - pleomorphism. Por exemplo, na gripe, as partículas virais podem ser consideradas como qualquer coisa das esferas 100nm no diâmetro por muito tempo, os filamentos estendido que podem alcançar diversos mícrons transversalmente.

Outros vírus conhecidos para exibir o pleomorphism incluem Ebola, sarampo, e vírus da doença de Newcastle. Infelizmente, este pleomorphism deficientemente é compreendido e apresenta uma barreira mais a compreender a estrutura e a morfologia dos vírus.

Agora, os pesquisadores da universidade de Oxford e a universidade de Warwick colaboraram para desenvolver um método para compreender e avaliar melhor estes pleiomorphisms. O trabalho dos pesquisadores está actualmente disponível no server da pré-impressão do bioRxiv* ao esperar a revisão paritária.

As partículas da gripe tendem a formar de comprimento em uma de três formas - esferas em torno de baciliforme do diâmetro 120nm, o ellipsoidal, o capsular, ou rim-feijão dado forma em torno de 120-250nm no diâmetro, ou nos filamentos sobre 250nm. Estes são cercados pelos bilayers do lipido que contêm pontos de superfície encaixados da proteína, ao redor 375 no total. Estes são na maior parte hemagglutinin (HA), mas aproximadamente um sétimo são neuraminidase (NA). Os pontos do NA tendem a formar conjuntos, frequentemente no extremo oposto do pólo ao genoma viral. Abaixo desta camada de superfície encontra-se uma matriz de proteínas estruturais, e abaixo do este mentiras o genoma. A maioria desta informação foi recolhida com a microscopia de elétron - a microscopia de fluorescência não tem geralmente a definição detectar a maioria de vírus, fazendo visão detalhada de partículas individuais perto de impossível.

Imagem lactente alta da produção da gripe usando o diagrama esquemático da microscopia da super-definição A) do protocolo de rotulagem. As amostras do vírus foram secadas directamente nas lamelas de vidro pré-revestidas com poli-L-lisina antes de ser fixas, permeabilised e manchadas com anticorpos usando um protocolo padrão da imunofluorescência. B) Um campo de visão representativo de uma imagem do widefield da gripe A/Udorn/72 etiquetada, imaged no canal verde. Μm da barra 10 da escala. C) Um FOV do representante de uma imagem do widefield de uma amostra negativa do vírus, imaged no canal verde. Μm da barra 10 da escala. D) A imagem correspondente do dSTORM do FOV em B), onde o HA é etiquetado no verde e no NA é etiquetada no vermelho. Μm da barra 10 da escala. POR EXEMPLO) imagens dentro zumbidas D) de mostrar filamentos individuais e partículas esféricas. Μm da barra 5 da escala.
Imagem lactente alta da produção da gripe usando o diagrama esquemático da microscopia da super-definição A) do protocolo de rotulagem. As amostras do vírus foram secadas directamente nas lamelas de vidro pré-revestidas com poli-L-lisina antes de ser fixas, permeabilized e manchadas com anticorpos usando um protocolo padrão da imunofluorescência. B) Um campo de visão representativo (FOV) de uma imagem do widefield da gripe A/Udorn/72 etiquetada, imaged no canal verde. Μm da barra 10 da escala. C) Um FOV do representante de uma imagem do widefield de uma amostra negativa do vírus, imaged no canal verde. Μm da barra 10 da escala. D) A imagem correspondente do dSTORM do FOV em B), onde o HA é etiquetado no verde e no NA é etiquetada no vermelho. Μm da barra 10 da escala. POR EXEMPLO) imagens dentro zumbidas D) de mostrar filamentos individuais e partículas esféricas. Μm da barra 5 da escala.

Infelizmente, a microscopia de elétron é cara e lenta. Os pesquisadores criaram uma técnica para promover a imagem lactente da alto-produção de virions filamentous combinando a microscopia óptica estocástica directa da reconstrução (dSTORM) - um método com uma definição de 20nm inferior - e o software de análise automatizada do rapid para permitir que os milhares de virions sejam identificados e analisados ao mesmo tempo.

Os cientistas centraram-se sobre uma tensão já bem-caracterizada da gripe A/Udorn/72 da gripe, que indica fenótipos esféricos e filamentous.

Revestindo o vidro com positivamente - poli-L-lisina ou chitosano linear cobrado dos polímeros, podiam imobilizar partículas do vírus nas corrediças. As partículas do vírus foram secadas directamente em lamelas revestidas com a poli-L-lisina e imaged elas que usam um microscópio de fluorescência da reflexão interna do total do widefield. Dez mil quadros de um único campo de visão (FOV) foram tomados para gerar uma imagem de alta resolução de um grande número partículas esféricas e do filamento de comprimentos diferentes. Estas imagens mostraram uma população convenientemente aleatória de partículas do filamento com os graus notáveis de variabilidade, variando entre 250nm a diversos mícrons longos. Alguns filamentos virais eram maiores do que as imagens usadas e exigidas do limite de difracção do largo-campo com sinais difracção-limitados.

O vírus foi etiquetado com um anticorpo anti-HA que permitisse que um encanamento da análise automatizada do rapid medisse o comprimento destes filamentos.

Após ter ajustado as imagens e ter excluído alguma partícula menor do que 234nm (porque estes estariam abaixo do limite de difracção), os pesquisadores usaram o software para preencher as diferenças de partículas do vírus com as áreas não etiquetadas, e tomaram a forma a mais simples possível.

Os comprimentos destas formas foram supor para estar a uns comprimentos das partículas do vírus. Quase 500 FOVs individuais eram imaged, e sobre 46.000 partículas filamentous foram medidos.

A análise revelou a grande maioria dos filamentos estava sob 1000nm por muito tempo. Isto é apoiado pelos estudos precedentes que mostram um risco aumentado de filamentos que quebram em uns comprimentos mais longos. o dSTORM e um algoritmo de aglomeração de DBSCAN foram usados para analisar moléculas menores, e a organização da proteína da superfície foi investigada com a análise da intensidade e Fourier transforma.

imagem lactente da Super-definição e análise de tamanho de partículas do vírus SARS-CoV-2. A) Uma imagem representativa da super-definição dos virions SARS-CoV-2 duplo-etiquetada com anti-ponto e anti-nucleoprotein (N) anticorpos preliminares e anticorpos secundários etiquetados com o Alexa647 (vermelho) e o Alexa546 (verde) respectivamente. Μm da barra 10 da escala. B&C) zumbiu imagens das partículas SARS-CoV-2 individuais (destacadas nas caixas brancas em A). Barra 100 nanômetro da escala. D) as localizações da Super-definição no canal verde (que etiqueta a proteína de N) foram aglomeradas e cada conjunto foi cabido com uma elipse para extrair dimensões da partícula. Um histograma dos comprimentos da linha central principal cabidos com uma função Gaussian mostra que os virions caem em uma única população, centrada em 143.8nm. E) O histograma da relação linha central principal/menor mostra uma única distribuição.
imagem lactente da Super-definição e análise de tamanho de partículas do vírus SARS-CoV-2. A) Uma imagem representativa da super-definição dos virions SARS-CoV-2 duplo-etiquetada com anti-ponto e anti-nucleoprotein (N) anticorpos preliminares e anticorpos secundários etiquetados com o Alexa647 (vermelho) e o Alexa546 (verde) respectivamente. Μm da barra 10 da escala. B&C) zumbiu imagens das partículas SARS-CoV-2 individuais (destacadas nas caixas brancas em A). Barra 100 nanômetro da escala. D) as localizações da Super-definição no canal verde (que etiqueta a proteína de N) foram aglomeradas e cada conjunto foram cabidas com uma elipse para extrair dimensões da partícula. Um histograma dos comprimentos da linha central principal cabidos com uma função Gaussian mostra que os virions caem em uma única população, centrada em 143.8nm. E) O histograma da relação linha central principal/menor mostra uma única distribuição.

Os cientistas destacam o uso que as técnicas acima mencionadas têm em analisar partículas virais rapidamente e em massa ao manter uma alta resolução. Para mostrar mais o serviço público de seu método, analisaram ràpida o vírus já-bem-caracterizado do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) ao efeito significativo. Este método podia ser inestimável na ajuda com trabalho urgente tal como a purificação do vírus identificando o número de virions filamentous ou rapidamente identificando o tamanho e a morfologia a fim acelerar a produção vacinal.

observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida

Journal reference:
Sam Hancock

Written by

Sam Hancock

Sam completed his MSci in Genetics at the University of Nottingham in 2019, fuelled initially by an interest in genetic ageing. As part of his degree, he also investigated the role of rnh genes in originless replication in archaea.

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