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proyección de imagen de la Estupendo-resolución y análisis de talla de las partículas del virus SARS-CoV-2

Lamentablemente, hemos hecho familiares con la carga de enfermedades virales durante los últimos dos años, con la enfermedad 2019 (COVID-19) del coronavirus demandando las vidas de millones de gente por todo el mundo.

Aunque la gripe no está generalmente en los títulos, no es infrecuente que los brotes del virus resulten hacia adentro sobre 650.000 muertes por año - o aún más cuando se tienen en cuenta las epidemias no-anuales irregulares.

Es común para los virus de la misma especie mostrar diferencias importantes de la forma y tamaño - pleomorphism. Por ejemplo, en gripe, las partículas virales se pueden considerar como cualquier cosa de las esferas 100nm en diámetro de largo, los filamentos extendidos que pueden alcanzar varios micrones a través.

Otros virus sabidos para exhibir pleomorphism incluyen Ebola, el sarampión, y el virus de la enfermedad de Newcastle. Lamentablemente, este pleomorphism es mal entendido y presenta una barrera más lejos a entender la estructura y la morfología de los virus.

Ahora, los investigadores de la universidad de Oxford y la universidad de Warwick han colaborado para desarrollar un método para entender y para evaluar mejor estos pleiomorphisms. El trabajo de los investigadores está actualmente disponible en el servidor de la prueba preliminar del bioRxiv* mientras que aguarda la revisión paritaria.

Las partículas de la gripe tienden a formar en una de tres formas - esferas alrededor de baciliforme del diámetro 120nm, elipsoidal, capsular, o riñón-haba dado forma alrededor de 120-250nm en diámetro, o filamentos sobre 250nm de largo. Éstos son rodeados por los bilayers del lípido que contienen picos superficiales embutidos de la proteína, alrededor 375 en total. Éstos son sobre todo hemagglutinin (HA), pero aproximadamente un séptimo es neuraminidasa (NA). Los picos del NA tienden a formar atados, a menudo en el extremo contrario del polo al genoma viral. Debajo de esta capa superficial miente una matriz de proteínas estructurales, y debajo de este las mentiras el genoma. La mayor parte de esta información fue recopilada con microscopia electrónica - la microscopia de fluorescencia no tiene generalmente la resolución de descubrir la mayoría de los virus, haciendo la visión detallada de partículas individuales cerca de imposible.

Alta proyección de imagen de la producción de la gripe usando el diagrama esquemático de la microscopia de la estupendo-resolución A) del protocolo de etiqueta. Las muestras del virus fueron secadas directamente sobre las tiras de cristal cubiertas primero con polivinílico-L-lisina antes de ser fijas, permeabilised y manchadas con los anticuerpos usando un protocolo estándar de la inmunofluorescencia. B) Un campo visual representativo de una imagen del widefield de la gripe etiqueta A/Udorn/72, reflejada en el canal verde. Μm de la barra 10 de la escala. C) Un FOV del representante de una imagen del widefield de una muestra negativa del virus, reflejada en el canal verde. Μm de la barra 10 de la escala. D) La imagen correspondiente del dSTORM del FOV en B), donde la ha etiqueta en verde y el NA etiqueta en rojo. Μm de la barra 10 de la escala. Imágenes del E.G.) hacia adentro empinadura D) de mostrar filamentos individuales y partículas esféricas. Μm de la barra 5 de la escala.
Alta proyección de imagen de la producción de la gripe usando el diagrama esquemático de la microscopia de la estupendo-resolución A) del protocolo de etiqueta. Las muestras del virus fueron secadas directamente sobre las tiras de cristal cubiertas primero con polivinílico-L-lisina antes de ser fijas, permeabilized y manchadas con los anticuerpos usando un protocolo estándar de la inmunofluorescencia. B) Un campo visual representativo (FOV) de una imagen del widefield de la gripe etiqueta A/Udorn/72, reflejada en el canal verde. Μm de la barra 10 de la escala. C) Un FOV del representante de una imagen del widefield de una muestra negativa del virus, reflejada en el canal verde. Μm de la barra 10 de la escala. D) La imagen correspondiente del dSTORM del FOV en B), donde la ha etiqueta en verde y el NA etiqueta en rojo. Μm de la barra 10 de la escala. Imágenes del E.G.) hacia adentro empinadura D) de mostrar filamentos individuales y partículas esféricas. Μm de la barra 5 de la escala.

Lamentablemente, la microscopia electrónica es costosa y lenta. Los investigadores han creado una técnica para ascender la proyección de imagen de la alto-producción de virions filamentosos combinando la microscopia óptica estocástica directa de la reconstrucción (dSTORM) - un método con una resolución de 20nm inferior - y el software de análisis automatizado del rapid para permitir que analizans los millares de virions sean determinados y al mismo tiempo.

Los científicos se centraron en una deformación ya bien-caracterizada de la gripe A/Udorn/72 de la gripe, que visualiza fenotipos esféricos y filamentosos.

Recubriendo el cristal con positivo - polivinílico-L-lisina o kitosán lineal cargada de los polímeros, podían inmovilizar partículas del virus en las diapositivas. Las partículas del virus fueron secadas directamente sobre las tiras recubiertas con polivinílico-L-lisina y reflejadas ellas usando un microscopio de fluorescencia de la reflexión interna del total del widefield. Los marcos de los diez milésimos de un único campo visual (FOV) fueron tomados para generar una imagen de alta resolución de un gran número de partículas esféricas y del filamento de diversos largos. Estas imágenes mostraron una población aparentemente al azar de partículas del filamento con los grados notables de variabilidad, colocando entre 250nm a varios micrones largos. Algunos filamentos virales eran más grandes que las imágenes usadas y requeridas del límite de difracción del ancho-campo con las señales difracción-limitadas.

El virus etiqueta con un anticuerpo anti-HA que permitió que una tubería del análisis automatizado del rapid midiera el largo de estos filamentos.

Después de ajustar las imágenes y de excluir cualesquiera partículas más pequeñas que 234nm (pues éstos estarían abajo del límite de difracción), los investigadores utilizaron software para completar los entrehierros de las partículas del virus de las áreas no etiqueta, y tomaron la forma más simple posible.

Los largos de estas formas fueron asumidos para ser los largos de las partículas del virus. Casi 500 FOVs individuales eran reflejados, y sobre 46.000 partículas filamentosas fueron medidos.

El análisis reveló a la gran mayoría de filamentos estaba bajo 1000nm de largo. Esto es soportada por los estudios anteriores que muestran un riesgo creciente de filamentos que se rompen en las longitudes más largas. el dSTORM y un algoritmo de agrupamiento de DBSCAN fueron utilizados para analizar moléculas más pequeñas, y la organización de la proteína de la superficie fue investigada con análisis de la intensidad y Fourier transforma.

proyección de imagen de la Estupendo-resolución y análisis de talla de las partículas del virus SARS-CoV-2. A) Una imagen representativa de la estupendo-resolución de los virions SARS-CoV-2 doble-etiqueta con los anticuerpos primarios del anti-pico y de la anti-nucleoproteína (n) y los anticuerpos secundarios etiqueta con Alexa647 (rojo) y Alexa546 (verde) respectivamente. Μm de la barra 10 de la escala. B&C) empinadura las imágenes de las partículas individuales SARS-CoV-2 (destacadas en las cajas blancas en A). Barra 100 nanómetro de la escala. D) las localizaciones de la Estupendo-resolución en el canal verde (etiqueta la proteína de N) fueron agrupadas y cada atado fue ajustado con una elipse para extraer dimensiones de la partícula. Un histograma de los largos del eje importante ajustados con una función gausiana muestra que los virions bajan en una única población, centrada en 143.8nm. E) El histograma de la índice del eje importante/de menor importancia muestra una única distribución.
proyección de imagen de la Estupendo-resolución y análisis de talla de las partículas del virus SARS-CoV-2. A) Una imagen representativa de la estupendo-resolución de los virions SARS-CoV-2 doble-etiqueta con los anticuerpos primarios del anti-pico y de la anti-nucleoproteína (n) y los anticuerpos secundarios etiqueta con Alexa647 (rojo) y Alexa546 (verde) respectivamente. Μm de la barra 10 de la escala. B&C) empinadura las imágenes de las partículas individuales SARS-CoV-2 (destacadas en las cajas blancas en A). Barra 100 nanómetro de la escala. D) las localizaciones de la Estupendo-resolución en el canal verde (etiqueta la proteína de N) fueron agrupadas y cada atado fueron ajustadas con una elipse para extraer dimensiones de la partícula. Un histograma de los largos del eje importante ajustados con una función gausiana muestra que los virions bajan en una única población, centrada en 143.8nm. E) El histograma de la índice del eje importante/de menor importancia muestra una única distribución.

Los científicos destacan el uso que las técnicas ya mencionadas tienen en analizar partículas virales rápidamente y en masa mientras que mantienen una alta resolución. Para mostrar más lejos la utilidad de su método, analizaban rápidamente el virus ya-bien-caracterizado del coronavirus 2 de la neumonía asiática (SARS-CoV-2) al efecto importante. Este método podía ser inestimable en la ayuda con el trabajo urgente tal como purificación del virus determinando el número de virions filamentosos o rápidamente determinando la talla y la morfología para acelerar la producción vaccínea.

advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida

Journal reference:
Sam Hancock

Written by

Sam Hancock

Sam completed his MSci in Genetics at the University of Nottingham in 2019, fuelled initially by an interest in genetic ageing. As part of his degree, he also investigated the role of rnh genes in originless replication in archaea.

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