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Ensaio molecular rápido para detectar seqüências do RNA de SARS-CoV-2-specific

Os pesquisadores de Israel descreveram um ensaio molecular novo para detectar ràpida os micróbios patogénicos com sensibilidade alta em amostras clínicas. O método combina um sistema biosensing da modulação magnética altamente (MMB) sensível, um ciclismo térmico rápido, e uma ponta de prova dobro-extinta alterada da hidrólise para detectar a presença de RNA.

Estudo:Uma modulação magnética biosensing-baseou o ensaio molecular para o rapid e o diagnóstico clínico altamente sensível de COVID-19. Crédito de imagem: CROCOTHERY/ShutterstockEstudo: Uma modulação magnética biosensing-baseou o ensaio molecular para o rapid e o diagnóstico clínico altamente sensível de COVID-19. Crédito de imagem: CROCOTHERY/Shutterstock

Publicado no jornal de diagnósticos moleculars, do estudo relatado a detecção rápida do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) com sensibilidade alta e a especificidade em amostras clínicas.

Fundo

A detecção rápida e sensível de micróbios patogénicos humanos é uma necessidade urgente, especialmente durante epidemias e pandemias. A pandemia em curso da doença 2019 do coronavirus (COVID-2019) causada por SARS-CoV-2 alertou a revelação rápida de métodos de selecção rápidos diversos para a detecção do micróbio patogénico.

Contudo, o teste da bandeira de ouro para SARS-CoV-2 é baseado actualmente na detecção transcrição-quantitativa reversa da reacção em cadeia da polimerase (RT-qPCR) do RNA vírus-específico na amostra, com um tempo de resposta de 90-120 minutos. Este ensaio confia na amplificação do alvo pela polimerase de Taq e usa uma ponta de prova transferência-baseada fluorescente (FRET) da hidrólise da energia de ressonância.

Quando tão pouco como uma única cópia de um RNA do alvo pode ser detectada teòrica pelo RT-qPCR, em geral, a fase do RT, a monitoração de tempo real, e o número alto de ciclos da amplificação forem demorados para a selecção rápida. Outros desafios nos métodos de selecção rápidos emocionantes incluem a taxa alta de resultados falso-negativos e de tempos de reacção longos.

Este estudo descreve um ensaio magnético novo de Biosensing (MMB) da modulação 3-4 vezes mais rapidamente do que o RT-qPCR padrão e supera as limitações da selecção rápida da pegada pequena existente.

O estudo

Os pesquisadores executaram o ensaio do CMM para o E-gene (envelope) e os alvos de N1-gene (nucleocapsid) neste estudam. Recolheram os cotonetes nasopharyngeal dos pacientes hospitalizados de COVID-19-positive. Recolheram amostras para o negativo SARS-CoV-2 ajustado antes do início da pandemia COVID-19 em Israel.

Os pesquisadores investigaram o ensaio do CMM das reacções de RT-PCR com ou sem o E-gene sintético do RNA SARS-CoV-2 em um teste ciclo-dependente da amplificação. Quando detectaram somente dez cópias in vitro de alvos transcritos do E-gene do RNA com 30 ciclos das amplificações, os ciclos óptimos para SNR melhorado são encontrados para ser executados em 40 ciclos da amplificação.

Transcrevendo o alvo do E-gene in vitro na água da PCR-categoria, os pesquisadores igualmente executaram cópias/ensaio reacção-dependente para determinar a sensibilidade analítica do ensaio. Calcularam o limite de detecção para ser 1,6 cópias/reacção.

Importante, os pesquisadores determinaram a sensibilidade e a especificidade clínicas do ensaio CMM-baseado do E-gene que segue 40 ciclos da amplificação. Para as 309 amostras clínicas, incluir 170 amostras de SARS-CoV-2-negative (30 de que seja positivo a outros vírus respiratórios), e as 139 amostras do RT-qPCR SARS-CoV-2-positive, pesquisadores mostrou que o ensaio do CMM teve a sensibilidade 100% a especificidade e 97,8% clínica para amostras com ≤ 42 do Ct.

Mais, os pesquisadores testaram a sensibilidade e a especificidade clínicas do ensaio CMM-baseado de N1-gene que segue 40 ciclos da amplificação. Usaram 70 amostras, incluindo 40 amostras de SARS-CoV-2-negative (30 de que seja positivo para outros vírus respiratórios) e 30 amostras do RT-qPCR SARS-CoV-2-positive.

Usando a mesma interrupção do ROC calculada para o ensaio CMM-baseado do E-gene, os pesquisadores identificaram todas as amostras negativas como o negativo, indicando a especificidade 100% pelo ensaio CMM-baseado N1-gene.

Correlacionando o valor do Ct e os sinais do CMM, os pesquisadores concluíram que o ensaio poderia fornecer, além do que resultados qualitativos exactos, resultados semiquantitativos tais como negativo, positivo da fronteira, e positivo. Significativamente, igualmente relataram que não havia nenhuma reactividade cruzada neste ensaio, indicativo da especificidade alta. Também, o estudo olha os custos associados do ensaio do CMM - espera-se ser mais barato do que o custo de um sistema RT-qPCR padrão.

Conclusões

Os pesquisadores aqui apresentaram um ensaio molecular rápido para detectar as seqüências do RNA de SARS-CoV-2-specific baseadas no ensaio do CMM. Demonstraram a sensibilidade e a especificidade clínicas para ser 97,8 e 100%, respectivamente.

Comparado ao teste RT-qPCR médio (90-120 minutos), os ensaios moleculars CMM-baseados com os 40 ciclos da amplificação tomaram somente 30 minutos (que incluem o tempo de manipulação). A detecção CMM-baseada é aproximadamente 150 vezes mais sensível do que a detecção óptica directa das moléculas fluorescentes (RT-qPCR).

Os pesquisadores relataram que esta plataforma do CMM estêve descrita previamente para detectar o sexo do vírus e da galinha de Ibaraki no ovo. Este é o primeiro relatório para descrever o ensaio do CMM para a detecção molecular de micróbios patogénicos humanos.

As primeiras demão e o grupo da ponta de prova neste ensaio podem ser ajustados para detectar facilmente outros micróbios patogénicos. O acoplamento com um dispositivo de detecção alto da produção para seleccionar ràpida grandes amostras em uma comunidade, este ensaio pode alterar a resposta a toda a situação pandémica.

Journal reference:
  • Margulis, M. et al. (2021) "A magnetic modulation biosensing-based molecular assay for rapid and highly sensitive clinical diagnosis of COVID-19", The Journal of Molecular Diagnostics. doi: 10.1016/j.jmoldx.2021.08.012.
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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