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Gli scienziati sviluppano un'analisi senza cellula per schermare gli inibitori dell'entrata SARS-CoV-2

Negli studi intrapresi all'istituto di tecnologia dell'Israele (Technion), l'Israele, scienziati ha sviluppato e convalidato un'analisi senza cellula della fluorescenza per la selezione rapida degli inibitori della proteina. Pricipalmente hanno messo a fuoco sugli inibitori del candidato che bloccano l'interazione fra il dominio dell'ricevitore-associazione della punta (RBD) del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo e l'enzima di conversione dell'angiotensina umano 2 (hACE2).

Studio: UnStudio: Un'analisi senza cellula per selezione rapida degli inibitori di hACE2-receptor - associazione di SARS-CoV-2-Spike. Credito di immagine: Dana.S/Shutterstock

Una versione della pubblicazione preliminare dello studio è disponibile sul " server " del bioRxiv* mentre l'articolo subisce la revisione tra pari.

Sfondo

SARS-CoV-2, l'agente patogeno causativo della malattia 2019 (COVID-19) di coronavirus, è avvolto, unico incagliato, virus a RNA di positivo-senso che soprattutto attacca le celle epiteliali di ACE2-expressing delle vie respiratorie umane. L'entrata virale della cellula ospite è mediata dall'interazione fra il ricevitore ACE2 della membrana cellulare ospite e la punta virale RBD, seguita da fusione della busta virale con la membrana cellulare ospite. Quindi, i piccoli inibitori della molecola che bloccano questa interazione possono servire da agenti terapeutici potenziali impedire l'infezione SARS-CoV-2.

Nello studio corrente, gli scienziati hanno sviluppato un'analisi senza cellula della fluorescenza che può essere usata per schermare gli inibitori del candidato di ACE2 - interazione di RBD.

L'analisi

L'analisi comprende le particelle fluorescenti RBD-rivestite del polistirolo che catturano hACE2 fluorescente contrassegnato in assenza di un inibitore. Una volta incubata con un inibitore, nessun'interazione si presenta fra RBD e ACE2. Ciò provoca la riduzione dei segnali fluorescenti che possono essere individuati facendo uso di citometria a flusso o di microscopia di fluorescenza. Gli scienziati in covalenza hanno ricoperto le particelle fluorescenti di RBD per generare le particelle del tipo di virion.

Convalida di analisi

Gli scienziati hanno eseguito gli esperimenti in vitro per convalidare la specificità delle particelle RBD-rivestite (particelle di virion) che legano a hACE2. I risultati hanno rivelato che le particelle del tipo di virion legano specificamente a hACE2 e non al tag fluorescente (mCherry) utilizzato nello studio.

Gli esperimenti che hanno condotto per determinare la sensibilità dell'analisi e la durata ha rivelato che le particelle del tipo di virion hanno alta sensibilità anche per una piccola quantità di hACE2. Tuttavia, un'più alta concentrazione di hACE2 ha fornito la più sensibilità per le particelle del tipo di virion. Inoltre, hanno stimato che il tempo di reazione ottimale per RBD - l'associazione ACE2 è 45 minuti.    

Il segnale che fluorescente hanno ottenuto in analisi era un segnale numerico bimodale o. Non c'era spostamento analogico delle particelle del tipo di virion dalla non fluorescenza ai valori della interamente fluorescenza. Ciò indica l'associazione cooperativa fra le particelle del tipo di virion e hACE2. Come suggerito dagli scienziati, questo cooperativity potrebbe essere a causa dei cambiamenti conformazionali hACE2 in arrivo che causano la più forte interazione con altre molecole hACE2.    

Hanno convalidato la funzionalità dell'analisi conducendo la reazione obbligatoria in presenza ed assenza di peptide anti--RBD sintetico. I risultati hanno mostrato una riduzione dipendente dalla dose continua di RBD - l'associazione hACE2 in presenza dell'inibitore sintetico. Ciò indica che l'analisi può essere usata per analizzare RBD - l'inibizione hACE2 quantitativo.

Interazione fra le particelle ed il RNA virali - granuli della proteina

In una serie di esperimenti separata, gli scienziati hanno esplorato l'affinità obbligatoria delle particelle del tipo di virion per RNA sintetico - granuli della proteina che si pensano che diminuissero la quantità di particelle virali attive. La parte del RNA dei granuli è stata composta di RNA lungo sintetico di non codifica e la parte della proteina è stata composta di hACE2. Questi granuli sono stati prodotti in vitro tramite l'auto-installazione.   

Meccanicistico, il RNA lungo di non codifica contiene le sedi del legame multiple per hACE2 e così, aumenta la concentrazione locale di hACE2. Ciò, a sua volta, facilita l'intrappolamento delle particelle virali, evidenziante il potenziale di RNA - granuli della proteina come agenti terapeutici anti-SARS-CoV-2.

I risultati di analisi hanno rivelato che le particelle del tipo di virion legano ai granuli del RNA di hACE2-coated con alte selettività e specificità. Ciò che trova conferma l'attività anti-SARS-CoV-2 di RNA - granuli della proteina.

Significato di studio

L'analisi senza cellula della fluorescenza sviluppata nello studio può essere usata schermare a rapido ed in modo redditizio gli inibitori dell'entrata SARS-CoV-2 senza richiedere le alte impostazioni del laboratorio del livello di sicurezza biologica. L'applicazione di analisi ha potuto essere estesa per valutare le interazioni fra i mutanti di RBD e hACE2 o altro recettori cellulari ospite.

avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Sanchari Sinha Dutta

Written by

Dr. Sanchari Sinha Dutta

Dr. Sanchari Sinha Dutta is a science communicator who believes in spreading the power of science in every corner of the world. She has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree and a Master's of Science (M.Sc.) in biology and human physiology. Following her Master's degree, Sanchari went on to study a Ph.D. in human physiology. She has authored more than 10 original research articles, all of which have been published in world renowned international journals.

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    Dutta, Sanchari Sinha. (2021, October 07). Gli scienziati sviluppano un'analisi senza cellula per schermare gli inibitori dell'entrata SARS-CoV-2. News-Medical. Retrieved on November 30, 2021 from https://www.news-medical.net/news/20211007/Scientists-develop-a-cell-free-assay-to-screen-SARS-CoV-2-entry-inhibitors.aspx.

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