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Os cientistas desenvolvem um ensaio sem célula para seleccionar inibidores da entrada SARS-CoV-2

Em um estudo conduzido no Instituto de Tecnologia de Israel (Technion), Israel, cientistas desenvolveu e validou um ensaio sem célula da fluorescência para a selecção rápida de inibidores da proteína. Focalizaram principalmente nos inibidores do candidato que obstruem a interacção entre o domínio receptor-obrigatório do ponto (RBD) do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) e a enzima deconversão humana 2 (hACE2).

Estudo: Um ensaio sem célula para a selecção rápida dos inibidores de hACE2-receptor - emperramento de SARS-CoV-2-Spike. Crédito de imagem: Dana.S/ShutterstockEstudo: Um ensaio sem célula para a selecção rápida dos inibidores de hACE2-receptor - emperramento de SARS-CoV-2-Spike. Crédito de imagem: Dana.S/Shutterstock

Uma versão da pré-impressão do estudo está disponível no server do bioRxiv* quando o artigo se submeter à revisão paritária.

Fundo

SARS-CoV-2, o micróbio patogénico causal da doença 2019 do coronavirus (COVID-19), é envolvido, único-encalhado, o vírus do RNA do positivo-sentido que ataca primeiramente pilhas epiteliais de ACE2-expressing das vias respiratórias humanas. A entrada viral da pilha de anfitrião é negociada pela interacção entre o receptor ACE2 da membrana de pilha do anfitrião e o ponto viral RBD, seguido pela fusão do envelope viral com a membrana de pilha do anfitrião. Assim, os inibidores pequenos da molécula que obstruem esta interacção podem servir como agentes terapêuticos potenciais para impedir a infecção SARS-CoV-2.

No estudo actual, os cientistas desenvolveram um ensaio sem célula da fluorescência que pudesse ser usado para seleccionar inibidores do candidato de ACE2 - interacção de RBD.

O ensaio

O ensaio inclui as partículas fluorescentes RBD-revestidas do poliestireno que capturam hACE2 fluorescente etiquetado na ausência de um inibidor. Quando incubada com um inibidor, nenhuma interacção ocorre entre RBD e ACE2. Isto conduz à redução dos sinais fluorescentes que podem ser detectados usar o cytometry de fluxo ou a microscopia de fluorescência. Os cientistas revestiram covalently partículas fluorescentes com o RBD para gerar virion-como partículas.

Validação do ensaio

Os cientistas conduziram in vitro experiências para validar a especificidade das partículas RBD-revestidas (partículas do virion) que ligam a hACE2. Os resultados revelaram que virion-como partículas ligue especificamente a hACE2 e não à etiqueta fluorescente (mCherry) usada no estudo.

As experiências que conduziram para determinar a sensibilidade do ensaio e a duração revelou aquela virion-como partículas tem a sensibilidade alta mesmo para uma pequena quantidade de hACE2. Contudo, uma concentração mais alta de hACE2 forneceu mais sensibilidade para virion-como partículas. Além disso, calcularam que o momento de reacção óptimo para RBD - o emperramento ACE2 é 45 minutos.    

O sinal que fluorescente obtiveram no ensaio era um sinal bimodal ou digital. Não havia nenhuma SHIFT análoga do virion-como partículas da não-fluorescência aos valores da completo-fluorescência. Isto indica o emperramento cooperativo no meio virion-como partículas e hACE2. Como sugerido pelos cientistas, este cooperativity poderia ser devido às mudanças conformational hACE2 de entrada que causam uma interacção mais forte com outras moléculas hACE2.    

Validaram a funcionalidade do ensaio conduzindo a reacção obrigatória na presença e na ausência de um anti-RBD peptide sintético. Os resultados mostraram uma redução dependente da dose contínua em RBD - hACE2 que liga na presença do inibidor sintético. Isto indica que o ensaio pode ser usado para analisar quantitively RBD - inibição hACE2.

Interacção entre partículas virais e RNA - grânulo da proteína

Em um grupo de experiências separado, os cientistas exploraram a afinidade obrigatória virion-como de partículas para o RNA sintético - os grânulo da proteína que são esperados reduzir a quantidade de partículas virais activas. A peça do RNA dos grânulo foi compor do RNA longo sintético da não-codificação, e a peça da proteína foa de hACE2. Estes grânulo produzidos in vitro através do auto-conjunto.   

Mechanistically, o RNA longo da não-codificação contem locais obrigatórios múltiplos para hACE2 e assim, aumenta a concentração local de hACE2. Isto, por sua vez, facilita a armadilha de partículas virais, destacando o potencial do RNA - grânulo da proteína como os agentes anti-SARS-CoV-2 terapêuticos.

Os resultados do ensaio revelaram que virion-como partículas ligue aos grânulo do RNA de hACE2-coated com selectividade e especificidade altas. Isto que encontra confirma a actividade anti-SARS-CoV-2 do RNA - grânulo da proteína.

Significado do estudo

O ensaio sem célula da fluorescência desenvolvido no estudo pode ser usado a ràpida e inibidores da entrada da tela SARS-CoV-2 do custo-eficaz sem exigir instalações altas do laboratório do nível da seguridade biológica. A aplicação do ensaio podia ser estendida para avaliar as interacções entre mutantes de RBD e hACE2 ou outros receptors da pilha de anfitrião.

observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Sanchari Sinha Dutta

Written by

Dr. Sanchari Sinha Dutta

Dr. Sanchari Sinha Dutta is a science communicator who believes in spreading the power of science in every corner of the world. She has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree and a Master's of Science (M.Sc.) in biology and human physiology. Following her Master's degree, Sanchari went on to study a Ph.D. in human physiology. She has authored more than 10 original research articles, all of which have been published in world renowned international journals.

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