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Detecção de Plasmonic de ácidos nucleicos isothermally amplificados e detecção da único-molécula de SARS-CoV-2

No caso dos testes ácidos nucleicos, a reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi a bandeira de ouro para o diagnóstico da único-molécula. a detecção da Único-molécula de micróbios patogénicos, tais como o coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), é chave à luta contra manifestações e pandemias das doenças infecciosas.

Actualmente, os readouts simples são obtidos usando a detecção calorimétrica com amplificação isothermal laço-negociada (LÂMPADA). Um estudo novo publicado no server da pré-impressão do medRxiv* encontra que a detecção plasmonic de amplicons da LÂMPADA com a hibridação do ácido deoxyribonucleic (ADN) permite a detecção da altamente específica e único-molécula do RNA SARS-CoV-2.

Estudo: A detecção da Único-Molécula de SARS-CoV-2 pela detecção de Plasmonic de Isothermally amplificou ácidos nucleicos.

Fundo

Os testes do PCR envolvem protocolos demorados e exigem a infra-estrutura do laboratório, que impossibilita seu uso no teste (POC) do ponto--cuidado. A LÂMPADA e outros métodos isothermal da amplificação emergiram como alternativas ao PCR e permitem o teste do POC.

Um problema associado com a LÂMPADA é que não pode distinguir o molde contra a amplificação non-templated e, em conseqüência, é suscetível aos resultados do falso positivo. Conseqüentemente, é importante planejar técnicas novas para identificar directamente as seqüências amplificadas com um esquema simplificado da detecção. Este tipo de técnica permitirá a disposição de plataformas diagnósticas com características aumentadas como readouts simples, a especificidade alta, e a sensibilidade da detecção da único-molécula.

Sobre o estudo

Neste estudo novo, os cientistas relataram um método robusto para a detecção do ácido nucleico. Este método é baseado na detecção plasmonic de amplicons da LÂMPADA com a hibridação do ADN, denominada LÂMPADA plasmonic.

Um modelo do RNA SARS-CoV-2 foi usado para esta análise, onde os pesquisadores mostraram que o método plasmonic da LÂMPADA conseguiu a detecção da único-molécula qual é um conjunto de ferramentas útil para reduzir a severidade da pandemia em curso.

Ilustração esquemática das etapas principais para a detecção plasmonic propor do RNA da único-molécula da LÂMPADA. O RNA viral é primeiro reverso transcrito e amplificado nos amplicons que são sujeitados às enzimas digestão da limitação, formando as repetições curtos que podem ser desnaturadas em oligonucleotides para a hibridação subseqüente do ADN ligada com os sensores plasmonic.

O estudo actual tem duas vantagens principais. Primeiramente, os pesquisadores desenvolveram os nanoshells do ouro e da liga de prata (Au-AG), que têm uma extinção quatro vezes mais forte nos comprimentos de onda visíveis. Adicionalmente, estes nanoshells fornecem um limite de detecção de vinte vezes mais baixo para oligonucleotides do que nanoparticles do Au.

Em segundo, os pesquisadores demonstraram que o método novo permitiria o corte dos amplicons complexos da LÂMPADA em repetições curtos. Estas repetições são melhoráveis para a hibridação com nanoshells do oligonucleotide-functionalized.

Os pesquisadores começados com a síntese dos nanoshells Au-AG titrating os nanoparticles de prata com HAuCl4. Em uma carga4 de HAuCl de 3,3 mL, a ausência de NaCA3 conduziu à formação de gaiolas finas e porosas. Isto poderia devido à estequiometria da reacção, onde um átomo do AG é substituído por um átomo do Au no caso de AuCl2-.

o traço Energia-dispersivo do raio X (EDX) de um escudo Au-AG mostrou que os elementos do Au e do AG estiveram distribuídos através da partícula inteira, desse modo, confirmando a estrutura ligada.

Síntese e caracterização dos nanoshells Au-AG. Uma ilustração esquemática do Au-AG descasca o crescimento baseado na reacção galvânico da substituição na presença de NaCA3. Imagens do BD TEM das partes alíquota tomadas da reacção quando 1,0 mL (b), 2,5 mL (c), e 10,0 mL (d) HAuCl4 foram injectados. Inserir mostram as imagens ampliadas de TEM (imagem de B, de C) e de HAADF-STEM (d) de partículas individuais. As barras da escala inserir são 10 nanômetro. E EDX que traça a imagem de uma partícula individual mostrada em (d).

Os pesquisadores avaliaram então o papel de NaCA3 no crescimento do escudo aumentando sua concentração. Em baixas concentrações, NaCA3 induz uma mistura das gaiolas e escudos, visto que, em umas concentrações mais altas, rende escudos como o produto final. A taxa de depósito aumentada de átomos do Au é essencial para o overgrowth preferencial de escudos ramificados ou porosos.

Subseqüentemente, as propriedades de LSPR dos nanoshells Au-AG foram investigadas, porque são cruciais para a detecção plasmonic. Os espectros da extinção revelaram claramente uma SHIFT máxima diferente entre gaiolas e escudos Au-AG.

O pico da extinção dos escudos Au-AG deslocou de 392 nanômetros (nm) a 530 nanômetro, quando aquele das gaiolas deslocou a uns comprimentos de onda próximo-infravermelhos mais longos. A mudança da intensidade da extinção das duas estruturas diferiu com uma tendência monótona da diminuição e da cair-aumentação, respectivamente, assim sugerindo que os escudos tivessem uma extinção mais alta do que as gaiolas. Os cientistas executaram então simulações numéricas adicionais para ganhar umas introspecções mais adicionais nas propriedades de LSPR dos escudos Au-AG.

O passo seguinte era examinar os nanoshells Au-AG como etiquetas para a detecção do oligonucleotide. Uma seqüência associada com o gene de SARS-CoV-2 N foi escolhida enquanto o alvo e duas seqüências complementares foram projectados subseqüentemente como pontas de prova.

Subseqüentemente, os espectros da extinção de LSPR foram gravados e normalizados em 537 nanômetro. Porque os escudos Au-AG e os nanoparticles do ouro têm tamanhos e formas similares, a propriedade melhorada de LSPR é provável o que causou o realce observado da sensibilidade. Um método ratiometric da quantificação foi adotado que melhorasse o desempenho analítico.

A última etapa era planejar um protocolo para combinar a LÂMPADA reversa da transcrição (RT-LAMP) com os nanoshells Au-AG plasmonic para a detecção da único-molécula de micróbios patogénicos tais como SARS-CoV-2.

Em um esforço para demonstrar a importância de seu uso clínico, os cientistas aplicaram a aproximação plasmonic integrada da LÂMPADA para detectar as amostras nasais do cotonete que foram cravadas com RNA SARS-COV-2. O desempenho analítico era impressionante e sugerido que os sensores Au-AG-escudo-baseados trabalhados bem e tinha usos potenciais no ajuste clínico. Os pesquisadores opinaram que a aproximação diagnóstica estabelecida deve ser adotada como uma plataforma da detecção do nucleico-ácido. Contudo, o grupo de primeiras demão e de seqüências de sondagem deve ser mudado.

Conclusão

Neste estudo, os cientistas desenvolveram a aproximação plasmonic da LÂMPADA para a detecção da único-molécula do RNA SARS-CoV-2. O trabalho actual fornece um conjunto de ferramentas diagnóstico os readouts simples e os limites de detecção ultralow que poderiam potencial ser aplicados em ajustes clínicos.

observação *Important

o medRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Priyom Bose

Written by

Dr. Priyom Bose

Priyom holds a Ph.D. in Plant Biology and Biotechnology from the University of Madras, India. She is an active researcher and an experienced science writer. Priyom has also co-authored several original research articles that have been published in reputed peer-reviewed journals. She is also an avid reader and an amateur photographer.

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    Bose, Priyom. (2021, October 11). Detecção de Plasmonic de ácidos nucleicos isothermally amplificados e detecção da único-molécula de SARS-CoV-2. News-Medical. Retrieved on January 27, 2022 from https://www.news-medical.net/news/20211011/Plasmonic-sensing-of-isothermally-amplified-nucleic-acids-and-single-molecule-detection-of-SARS-CoV-2.aspx.

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