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Rôle de biocapteur visuel de CRISPR-Cas12a dans le dépistage de SARS-CoV-2

La pandémie actuelle de la maladie 2019 de coronavirus (COVID-19) est provoquée par la circulation globale du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère, qui est hautement transmissible et contagieux. L'identification immédiate du virus a été exigée pour la prévention épidémique, ainsi que contrôlant la propagation du virus.

Étude : Un biocapteur visuel basé sur Smartphone pour CRISPR-CAS a actionné la diagnose SARS-CoV-2. Crédit d'image : Photos de ci/Shutterstock.com

Mouvement propre

L'amplification en chaîne par polymérase en temps réel quantitative (qPCR) a été la méthode la plus populaire pour le dépistage de SARS-CoV-2. Jusqu'à présent, cette méthode a été normalisée par l'Organisation Mondiale de la Santé (WHO) pour le diagnostic de COVID-19.

Récent, les répétitions palindromiques courtes régulièrement interspaced groupées (CRISPR), avec les gènes CRISPR-associés (Cas), ont expliqué l'énorme potentiel dans biosensing. Certains systèmes de CRISPR-CAS tels que Cas13a et Cas12a se sont avérés pour effectuer des activités non spécifiques de coupe d'acide nucléique à la reconnaissance d'une séquence d'objectif. Cette activité est également connue comme activité de transport-clivage, qui a mené au dépistage de l'acide nucléique avec la sensibilité et la sélectivité élevées.

Des progrès récents ont été effectués dans le dépistage SARS-CoV-2 utilisant CRISPR-Cas13a ou CRISPR-Cas12a, ajouté aux lectures fluorescentes de signe ou aux lectures colorimétriques de signe dans les analyses transversales de papier de flux.  Cependant, la sensibilité et la sélectivité de ces méthodes exigent davantage d'amélioration pour fournir au rendement satisfaisant les échantillons cliniques.

En outre, les applications des nanoparticles plasmonic d'or (AuNPs) dans biosensing ont gagné l'importance ces dernières années. Plusieurs avantages des smartphones tels que leur interactivité, portabilité, et appareils-photo, se sont également avérés importants dans biosensing. Le couplage des smartphones avec biosensing fournit un dispositif analytique inducteur-déployable et convivial.

Une étude neuve publiée dans les biocapteurs de tourillon et la bioélectronique ont visé à développer un biocapteur visuel actionné par CRISPR-Cas12a de roman pour le dépistage de SARS-CoV-2.

Découvertes d'étude

L'acide ribonucléique viral (ARN) a été extrait, inverse transcrit, et amplifié à l'aide des amorces de gène-détail de SARS-CoV-2 N pour obtenir les amplicons bicaténaires d'acide désoxyribonucléique (dsDNA). Le composé de Cas12a-crRNA a identifié les amplicons de dsDNA, suivant que le transport-clivage du ssDNA a été commencés.

Si le ssDNA est marqué avec un (f) fluorophore au ′ 5 et à un extincteur (q) à 3' des extrémités, le clivage a mené à une condition unquenched. Ceci a eu comme conséquence les signes fluorescents améliorés qui ont été employés pour l'analyse quantitative du dsDNA d'objectif. Supplémentaire, un ssDNA de lieur a été employé pour hybrider avec des paires pré-effectuées de la sonde AuNPs-ADN par l'intermédiaire de l'appareillement de base complémentaire.

Faute d'objectif ADN, le ssDNA de lieur demeurerait non coupé, menant à la totalisation hybridation-induite des sondes d'AuNPs qui pourraient subir le « avancement du film. » Ceci a eu comme conséquence un déplacement vers le rouge dans leur absorbance, tournant les solutions sans couleur après centrifugation.

En présence de l'objectif ADN, le clivage a eu lieu et il n'y avait aucune totalisation des sondes d'AuNPs. Ceci a eu comme conséquence la solution étant colorée après centrifugation.

Ces changements de couleur ont pu être captés par un smartphone montés avec la récolteuse APP de couleur ou l'oeil nu. Ainsi, le dépistage de SARS-CoV-2 a eu lieu basé sur les changements de couleur.

CRISPR-Cas12a est-il faisable pour le dépistage de SARS-CoV-2 ?

Pour déterminer la faisabilité du dépistage de CRISPR-Cas12a-based, le cRNA a été conçu pour correspondre à une partie du gène du nucleocapsid (n). Le cRNA conçu et des amorces d'ACP ont été hautement économisés et alignés sur quelques uns des coronaviruses relatifs comprenant le syndrôme respiratoire aigu sévère (Radars à ouverture synthétique-CoV), le syndrome respiratoire de Moyen-Orient (MERS-CoV), et les coronaviruses humains (HumanCoV) pour le bilan de leur spécificité.

Après ceci, quelques expériences de préliminaire ont été effectuées sur le plasmide qui a contenu l'éclat de gène de N de SARS-CoV-2. Les résultats de l'expérience ont indiqué que le transport-clivage de Cas12a a été déclenché seulement en présence des amplicons et du crRNA de dsDNA de gène de l'objectif N.

En outre, on a conçu une analyse de sélectivité qui a prouvé que les intensités de fluorescence des échantillons seulement SARS-CoV-2 ont été augmentées. Ceci a expliqué que la sélectivité était élevée sans réaction croisée des objectifs non-SARS-CoV-2.

D'ailleurs, le dépistage de l'ARN SARS-CoV-2 a eu lieu avec l'aide du composé de Cas12a-crRNA. Les résultats ont indiqué qu'il y avait une relation linéaire entre l'ARN et les intensités de fluorescence.

Le dépistage de SARS-CoV-2 a été stimulé par la production des lentiviruses hébergeant les éclats génomiques (gène de N) de SARS-CoV-2. Les résultats de l'analyse ont indiqué que le transport-clivage de CRISPR-Cas12a pourrait être utile pour le dépistage de SARS-CoV-2. Supplémentaire, on l'a également constaté que le rendement de l'analyse fluorescente de CRISPR-Cas12a était tout à fait comparable à celui de l'analyse qRT-ACP traditionnelle.

Pour effectuer le dépistage rapide de SARS-CoV-2, on a développé une méthode de dépistage visuelle qui était indépendant du lecteur de microplate et pourrait être facilement affichée avec l'aide d'un smartphone. Par conséquent, le biocapteur proposé a été vérifié avec les pseudoviruses qui ont contenu l'éclat de N.

Les résultats ont indiqué que le tube exempt des acides SARS-CoV-2 nucléiques spécifiques était sans couleur après centrifugation. Comparativement, le tube qui a contenu les acides SARS-CoV-2 nucléiques spécifiques a manifesté une pente des changements de couleur qui dépendaient de la concentration du SARS-CoV-2.

le dépistage sans amplification des pseudoviruses SARS-CoV-2 a indiqué la limite du dépistage (LOD) pour être 106 copies/microlitres (μL), qui était tout à fait plus élevé que le dépistage adopté par amplification. En outre, une corrélation linéaire a existé entre la concentration du pseudovirus. Des valeurs de légèreté ont été obtenues par l'appareil-photo de smartphone.

D'ailleurs, des biocapteurs fluorescents et visuels du CRISPRCas12a se sont avérés pour avoir la compatibilité 100% avec le qPCR. L'endroit sous la valeur de courbure (AUV) était meilleur pour cette méthode par rapport au qPCR.

La répétabilité et la reproductibilité sont considérées importante pour le développement de biocapteur. L'enquête sur les valeurs relatives (RSD) d'écarts-type s'est avérée moins de 6%, qui a correspondu à la répétabilité et à la reproductibilité acceptables.

Deux smartphones différents avec différents appareils-photo ont été employés pour déterminer si la différence dans la lumière et l'appareil-photo pourrait produire des irrégularités dans les résultats. Bien que les deux appareils-photo aient produit la légère variation, ils n'étaient pas statistiquement significatifs. Ceci a proposé que le biocapteur proposé pourrait être employé dans différents smartphones et conditions légères variables.

Échantillons respiratoires cliniques impliqués d'étude actuelle les 50, dont hors 20 ont été affectés par COVID-19, et 30 ont été obtenus à partir des sujets sains. Les échantillons d'ARN obtenus à partir de tous les sujets ont été inverse transcrits et amplifiés par ACP.

Les produits d'ACP ont été alors vérifiés par le biocapteur visuel actionné par CRISPR-Cas12a. Les résultats ont indiqué que le biocapteur visuel de CRISPR-Cas12a pouvait correctement recenser et différencier les 50 positifs et les échantillons négatifs, juste comme le qPCR traditionnel donne droit.

Limitations

Bien que l'étude actuelle ait été tout à fait efficace en déterminant le potentiel du biocapteur visuel de CRISPR-Cas12a dans le dépistage de SARS-CoV-2, elle a eu certaines limitations.

Premièrement, l'amplification d'ACP exige les cycles thermiques qui pourraient être remplacés par une certaine technologie isotherme d'amplification. Deuxièmement, le biocapteur a comporté le transfert liquide multipas qui pourrait être intégré dans une réaction d'unique-bac, qui aiderait à réduire à un minimum l'instrumentation et à simplifier la procédure.

Journal reference:
  • Ma, L., Yin, L., Li, X., et al. (2021). A smartphone-based visual biosensor for CRISPR-Cas powered SARS-CoV-2 diagnostics. Biosensors and Bioelectronics 195. doi:10.1016/j.bios.2021.113646.
Suchandrima Bhowmik

Written by

Suchandrima Bhowmik

Suchandrima has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Microbiology and a Master of Science (M.Sc.) degree in Microbiology from the University of Calcutta, India. The study of health and diseases was always very important to her. In addition to Microbiology, she also gained extensive knowledge in Biochemistry, Immunology, Medical Microbiology, Metabolism, and Biotechnology as part of her master's degree.

Citations

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