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Ruolo del biosensore visivo di CRISPR-Cas12a nella rilevazione di SARS-CoV-2

La pandemia corrente di malattia 2019 di coronavirus (COVID-19) è causata dalla circolazione globale del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo, che è altamente ereditario e contagioso. L'identificazione rapida del virus è stata richiesta per la prevenzione epidemica come pure gestendo la diffusione del virus.

Studio: Ad un biosensore visivo basato a Smartphone per CRISPR-CAS ha alimentato i sistemi diagnostici SARS-CoV-2. Credito di immagine: Foto/Shutterstock.com di ci

Sfondo

La reazione a catena in tempo reale quantitativa della polimerasi (qPCR) è stata il metodo più popolare per la rilevazione di SARS-CoV-2. Fin qui, questo metodo è stato standardizzato dall'organizzazione mondiale della sanità (WHO) per la diagnosi di COVID-19.

Recentemente, le brevi ripetizioni palindromiche regolarmente interspaced ragruppate (CRISPR), insieme ai geni CRISPR-associati (Cas), hanno dimostrato il potenziale enorme nel biosensing. Determinati sistemi di CRISPR-CAS quali Cas13a e Cas12a sono stati trovati per svolgere le attività non specifiche di taglio dell'acido nucleico su riconoscimento di una sequenza dell'obiettivo. Questa attività egualmente è conosciuta come l'attività di trans-fenditura, che piombo alla rilevazione di acido nucleico con l'alte sensibilità e selettività.

Gli avanzamenti recenti sono stati fatti nella rilevazione SARS-CoV-2 facendo uso di CRISPR-Cas13a o di CRISPR-Cas12a, accoppiato con le letture fluorescenti del segnale o le letture colorimetriche del segnale nelle analisi laterali di carta di flusso.  Tuttavia, la sensibilità e la selettività di questi metodi richiedono ulteriore miglioramento per la fornitura della prestazione soddisfacente i campioni clinici.

Ancora, le applicazioni delle nanoparticelle plasmonic dell'oro (AuNPs) nel biosensing hanno assunto negli ultimi anni l'importanza. Parecchi vantaggi degli smartphones quali la loro interattività, trasferibilità e macchine fotografiche, egualmente sono stati trovati per essere importanti nel biosensing. L'accoppiamento degli smartphones con biosensing fornisce un'unità analitica campo-schierabile e facile da usare.

Un nuovo studio pubblicato nei biosensori del giornale e la bioelettronica hanno mirato a sviluppare un biosensore visivo alimentato CRISPR-Cas12a del romanzo per la rilevazione di SARS-CoV-2.

Risultati di studio

L'acido ribonucleico virale (RNA) è stato estratto, inverso è stato trascritto ed è stato ampliato per mezzo delle mani di fondo gene-specifiche di SARS-CoV-2 N per ottenere i amplicons a doppia elica dell'acido desossiribonucleico (dsDNA). Il complesso di Cas12a-crRNA ha riconosciuto i amplicons del dsDNA, seguenti che la trans-fenditura di ssDNA è stata iniziata.

Se lo ssDNA è contrassegnato con un fluorophore (F) a ′ 5 e ad un quencher (q) a 3' le estremità, la fenditura piombo ad uno stato unquenched. Ciò ha provocato i segnali fluorescenti migliorati che sono stati usati per l'analisi quantitativa del dsDNA dell'obiettivo. Ulteriormente, uno ssDNA del linker è stato usato per ibridare con le paia pre-fatte della sonda AuNPs-DNA via l'accoppiamento basso complementare.

In assenza del DNA dell'obiettivo, lo ssDNA del linker rimarrebbe non tagliato, piombo dall'all'aggregazione indotta da ibridazione delle sonde di AuNPs che potrebbero subire “il pulldown.„ Ciò ha provocato uno spostamento verso il rosso nella loro capacità di assorbimento, girante le soluzioni incolori dopo centrifugazione.

In presenza del DNA dell'obiettivo, la fenditura ha avuto luogo e non c'era l'aggregazione delle sonde di AuNPs. Ciò ha provocato la soluzione che è colorata dopo la centrifugazione.

Questi cambiamenti di colore hanno potuto essere catturati da uno smartphone installato con la raccoglitrice App di colore o l'occhio nudo. Quindi, la rilevazione di SARS-CoV-2 ha avuto luogo basato sui cambiamenti di colore.

È CRISPR-Cas12a fattibile per la rilevazione di SARS-CoV-2?

Per determinare la possibilità di rilevazione di CRISPR-Cas12a-based, il cRNA è stato destinato per corrispondere alla parte del gene del nucleocapsid (n). Il cRNA progettato e le mani di fondo di PCR altamente sono stati conservati e stato stati allineato a alcuni dei coronaviruses relativi compreso la sindrome respiratorio acuto severo (SAR-CoV), la sindrome respiratoria di Medio Oriente (MERS-CoV) e i coronaviruses umani (HumanCoV) per la valutazione della loro specificità.

A seguito di questo, alcuni esperimenti di preliminare sono effettuato stati sul plasmide che ha contenuto il frammento del gene di N di SARS-CoV-2. I risultati dell'esperimento hanno indicato che la trans-fenditura di Cas12a è stata avviata soltanto in presenza dei amplicons e del crRNA del dsDNA del gene dell'obiettivo N.

Ancora, un'analisi di selettività è stata progettata che ha indicato che le intensità della fluorescenza soltanto dei campioni SARS-CoV-2 sono state aumentate. Ciò ha dimostrato che la selettività era alta senza reazione crociata degli obiettivi non-SARS-CoV-2.

Inoltre, la rilevazione di RNA SARS-CoV-2 ha avuto luogo con l'aiuto del complesso di Cas12a-crRNA. I risultati hanno indicato che c'era una relazione lineare fra il RNA e le intensità della fluorescenza.

La rilevazione di SARS-CoV-2 è stata stimolata dalla produzione dei lentiviruses che harboring i frammenti genomica (gene di N) di SARS-CoV-2. I risultati dell'analisi hanno indicato che la trans-fenditura di CRISPR-Cas12a potrebbe essere utile per la rilevazione di SARS-CoV-2. Ulteriormente, egualmente è stato trovato che la prestazione dell'analisi fluorescente di CRISPR-Cas12a era abbastanza comparabile con quella dell'analisi tradizionale qRT-PCR.

Per effettuare la tempestiva rilevazione di SARS-CoV-2, un metodo di rilevazione visiva è stato messo a punto che era indipendente dal lettore del microplate e potrebbe essere letto facilmente per mezzo di uno smartphone. Di conseguenza, il biosensore proposto è stato provato con gli pseudoviruses che hanno contenuto il frammento di N.

I risultati hanno indicato che il tubo privo degli acidi nucleici specifici SARS-CoV-2 era incolore dopo centrifugazione. Comparativamente, il tubo che ha contenuto gli acidi nucleici specifici SARS-CoV-2 video un grado dei cambiamenti di colore che dipendevano dalla concentrazione del SARS-CoV-2.

la rilevazione senza amplificazione degli pseudoviruses SARS-CoV-2 ha indicato il limite di rilevazione (LOD) per essere 106 copia/microliter (μL), che era abbastanza superiore alla rilevazione adottata amplificazione. Ancora, una correlazione lineare è esistito fra la concentrazione dello pseudovirus. I valori di leggerezza sono stati ottenuti dalla macchina fotografica dello smartphone.

Inoltre, i biosensori fluorescenti e visivi del CRISPRCas12a sono stati trovati per avere consistenza 100% con qPCR. L'area nell'ambito del valore della curva (AUV) era migliore per questo metodo rispetto a qPCR.

La ripetibilità e la riproducibilità sono considerate importante per lo sviluppo del biosensore. L'indagine sui valori relativi (RSD) di deviazioni standard è stata trovata per essere meno di 6%, che ha corrisposto a ripetibilità ed alla riproducibilità accettabili.

Due smartphones differenti con differenti macchine fotografiche sono stati utilizzati per determinare se la differenza all'indicatore luminoso ed a macchina fotografica potesse produrre le discrepanze nei risultati. Sebbene le due macchine fotografiche producano la leggera variazione, non erano statisticamente significative. Ciò ha suggerito che il biosensore proposto potrebbe essere usato con differenti smartphones e condizioni di luce varianti.

Lo studio corrente ha compreso 50 campioni respiratori clinici, da cui 20 sono stati influenzati da COVID-19 e 30 sono stati ottenuti dagli individui sani. I campioni del RNA ottenuti da tutti gli oggetti inverso sono stati trascritti ed ampliato stati dalla PCR.

I prodotti di PCR poi sono provato stati dal biosensore visivo alimentato CRISPR-Cas12a. I risultati hanno indicato che il biosensore visivo di CRISPR-Cas12a poteva identificare e differenziare correttamente i 50 positivi ed i campioni negativi, appena come il qPCR tradizionale risulta.

Limitazioni

Sebbene lo studio corrente sia abbastanza efficace nella determinazione del potenziale del biosensore visivo di CRISPR-Cas12a nella rilevazione di SARS-CoV-2, ha presentato determinate limitazioni.

In primo luogo, l'amplificazione di PCR richiede i cicli termici che potrebbero essere sostituiti da una certa tecnologia isotermica di amplificazione. Secondariamente, il biosensore ha compreso il trasferimento liquido a più gradi che potrebbe essere integrato in una reazione del unico vaso, che avrebbe contribuito a minimizzare la strumentazione e semplificare la procedura.

Journal reference:
  • Ma, L., Yin, L., Li, X., et al. (2021). A smartphone-based visual biosensor for CRISPR-Cas powered SARS-CoV-2 diagnostics. Biosensors and Bioelectronics 195. doi:10.1016/j.bios.2021.113646.
Suchandrima Bhowmik

Written by

Suchandrima Bhowmik

Suchandrima has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Microbiology and a Master of Science (M.Sc.) degree in Microbiology from the University of Calcutta, India. The study of health and diseases was always very important to her. In addition to Microbiology, she also gained extensive knowledge in Biochemistry, Immunology, Medical Microbiology, Metabolism, and Biotechnology as part of her master's degree.

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