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Papel do biosensor visual de CRISPR-Cas12a na detecção de SARS-CoV-2

A pandemia actual da doença 2019 do coronavirus (COVID-19) é causada pela circulação global do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), que é altamente transmissível e contagioso. A identificação alerta do vírus foi exigida para a prevenção epidémica, assim como controlando a propagação do vírus.

Estudo: Um biosensor visual Smartphone-baseado para CRISPR-CAS pôs os diagnósticos SARS-CoV-2. Crédito de imagem: Fotos do CI/Shutterstock.com

Fundo

A reacção em cadeia quantitativa da polimerase do tempo real (qPCR) foi o método o mais popular para a detecção de SARS-CoV-2. Até agora, este método foi estandardizado pela Organização Mundial de Saúde (WHO) para o diagnóstico de COVID-19.

Recentemente, as repetições palíndromas curtos regularmente interspaced aglomeradas (CRISPR), junto com os genes CRISPR-associados (Cas), demonstraram o potencial enorme em biosensing. Determinados sistemas de CRISPR-CAS tais como Cas13a e Cas12a foram encontrados para realizar actividades não específicas da estaca do ácido nucleico após reconhecimento de uma seqüência do alvo. Esta actividade é sabida igualmente como a actividade da transporte-segmentação, que conduziu à detecção de ácido nucleico com sensibilidade e selectividade altas.

Os avanços recentes foram feitos na detecção SARS-CoV-2 usando CRISPR-Cas13a ou CRISPR-Cas12a, acoplado com readouts fluorescentes do sinal ou readouts colorimetric do sinal nos ensaios laterais de papel do fluxo.  Contudo, a sensibilidade e a selectividade destes métodos exigem uma melhoria mais adicional fornecendo o desempenho satisfatório as amostras clínicas.

Além disso, as aplicações de nanoparticles plasmonic do ouro (AuNPs) em biosensing têm ganhado a importância nos últimos anos. Diversas vantagens dos smartphones tais como suas interactividade, mobilidade, e câmeras, foram encontradas igualmente para ser importantes em biosensing. O acoplamento dos smartphones com biosensing fornece um dispositivo analítico campo-deployable e de fácil utilização.

Um estudo novo publicado nos Biosensors do jornal e a bioelectrónica apontaram desenvolver um biosensor visual posto CRISPR-Cas12a da novela para a detecção de SARS-CoV-2.

Resultados do estudo

O ácido ribonucléico viral (RNA) foi extraído, transcrito reversa, e amplificado com a ajuda das primeiras demão gene-específicas de SARS-CoV-2 N para obter dobro-encalhou amplicons do ácido deoxyribonucleic (dsDNA). O complexo de Cas12a-crRNA reconheceu os amplicons do dsDNA, seguindo que a transporte-segmentação do ssDNA foi iniciada.

Se o ssDNA é etiquetado com um (f) fluoróforo no ′ 5 e em um quencher (Q) em 3' as extremidades, a segmentação conduziram a um estado unquenched. Isto conduziu aos sinais fluorescentes aumentados que foram usados para a análise quantitativa do dsDNA do alvo. Adicionalmente, um ssDNA do linker foi usado para cruzar com pares pre-feitos da ponta de prova AuNPs-ADN através do emparelhamento baixo complementar.

Na ausência do ADN do alvo, o ssDNA do linker permaneceria sem cortes, conduzindo à agregação hibridação-induzida das pontas de prova de AuNPs que poderiam se submeter ao “pulldown.” Isto conduziu a um redshift em sua absorvência, girando as soluções incolores após a centrifugação.

Na presença do ADN do alvo, a segmentação ocorreu e não havia nenhuma agregação de pontas de prova de AuNPs. Isto conduziu à solução que está sendo colorida após a centrifugação.

Estas mudanças da cor podiam ser capturadas por um smartphone instalado com máquina desbastadora App da cor ou o olho nu. Assim, a detecção de SARS-CoV-2 ocorreu baseado nas mudanças da cor.

É CRISPR-Cas12a praticável para a detecção de SARS-CoV-2?

Para determinar a possibilidade da detecção de CRISPR-Cas12a-based, o cRNA foi projectado corresponder à parte do nucleocapsid (N) gene. O cRNA projetado e as primeiras demão do PCR altamente foram conservados e alinhados a alguns dos coronaviruses relacionados que incluem a Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV), a síndrome respiratória de Médio Oriente (MERS-CoV), e coronaviruses humanos (HumanCoV) para a avaliação de sua especificidade.

Depois disto, algumas experiências da preliminar foram realizadas no plasmídeo que conteve o fragmento do gene de N de SARS-CoV-2. Os resultados da experiência indicaram que a transporte-segmentação de Cas12a estêve provocada somente na presença dos amplicons e do crRNA do dsDNA do gene do alvo N.

Além disso, um ensaio da selectividade foi projectado que mostrasse que as intensidades da fluorescência somente das amostras SARS-CoV-2 estiveram aumentadas. Isto demonstrou que a selectividade era alta sem reacção cruzada dos alvos non-SARS-CoV-2.

Além disso, a detecção do RNA SARS-CoV-2 ocorreu com a ajuda do complexo de Cas12a-crRNA. Os resultados indicaram que havia um relacionamento linear entre o RNA e as intensidades da fluorescência.

A detecção de SARS-CoV-2 foi estimulada pela produção de lentiviruses que abrigam fragmentos genomic (gene de N) de SARS-CoV-2. Os resultados do ensaio indicaram que a transporte-segmentação de CRISPR-Cas12a poderia ser útil para a detecção de SARS-CoV-2. Adicionalmente, igualmente encontrou-se que o desempenho do ensaio fluorescente de CRISPR-Cas12a era bastante comparável com o aquele da análise qRT-PCR tradicional.

Para realizar a detecção rápida de SARS-CoV-2, um método de detecção visual foi desenvolvido que fosse independente do leitor do microplate e pudesse facilmente ser lido com a ajuda de um smartphone. Conseqüentemente, o biosensor propor foi testado com pseudoviruses que contiveram o fragmento de N.

Os resultados indicaram que a câmara de ar desprovido dos ácidos SARS-CoV-2 nucleicos específicos era incolor após a centrifugação. Comparativamente, a câmara de ar que conteve os ácidos SARS-CoV-2 nucleicos específicos indicou uma categoria de mudanças da cor que eram dependentes da concentração do SARS-CoV-2.

a detecção Amplificação-livre dos pseudoviruses SARS-CoV-2 indicou o limite de detecção (LOD) para ser 106 cópias/microlitros (μL), que era bastante mais alto do que a detecção adotada amplificação. Além disso, uma correlação linear existiu entre a concentração do pseudovirus. Os valores da luminosidade foram obtidos pela câmera do smartphone.

Além disso, os biosensors fluorescentes e visuais do CRISPRCas12a foram encontrados para ter a consistência 100% com qPCR. A área sob o valor da curva (AUV) era melhor para este método em relação ao qPCR.

A repetibilidade e a reprodutibilidade são consideradas importante para a revelação do biosensor. A investigação dos valores relativos dos desvios (RSD) padrão foi encontrada para ser menos de 6%, que correspondeu com a repetibilidade e a reprodutibilidade aceitáveis.

Dois smartphones diferentes com câmeras diferentes foram usados para determinar se a diferença na luz e na câmera poderia produzir discrepâncias nos resultados. Embora as duas câmeras produzissem a variação ligeira, não eram estatìstica significativas. Isto sugeriu que o biosensor propor poderia ser usado com smartphones diferentes e circunstâncias claras de variação.

O estudo actual envolveu 50 amostras respiratórias clínicas, fora de que 20 foram afectados por COVID-19, e 30 foram obtidos dos assuntos saudáveis. As amostras do RNA obtidas de todos os assuntos reversa foram transcritas e amplificadas pelo PCR.

Os produtos do PCR foram testados então pelo biosensor visual posto CRISPR-Cas12a. Os resultados indicaram que o biosensor visual de CRISPR-Cas12a podia identificar e diferenciar correctamente os 50 positivos e amostras negativas, apenas como o qPCR tradicional resultam.

Limitações

Embora o estudo actual fosse bastante eficaz em determinar o potencial do biosensor visual de CRISPR-Cas12a na detecção de SARS-CoV-2, teve determinadas limitações.

Em primeiro lugar, a amplificação do PCR exige os ciclos térmicos que poderiam ser substituídos por alguma tecnologia isothermal da amplificação. Em segundo lugar, o biosensor compreendeu transferência líquida multistep que poderia ser integrada em uma reacção do único-potenciômetro, que ajudasse a minimizar a instrumentação e simplificar o procedimento.

Journal reference:
  • Ma, L., Yin, L., Li, X., et al. (2021). A smartphone-based visual biosensor for CRISPR-Cas powered SARS-CoV-2 diagnostics. Biosensors and Bioelectronics 195. doi:10.1016/j.bios.2021.113646.
Suchandrima Bhowmik

Written by

Suchandrima Bhowmik

Suchandrima has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Microbiology and a Master of Science (M.Sc.) degree in Microbiology from the University of Calcutta, India. The study of health and diseases was always very important to her. In addition to Microbiology, she also gained extensive knowledge in Biochemistry, Immunology, Medical Microbiology, Metabolism, and Biotechnology as part of her master's degree.

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