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L'étude indique un système d'examen critique COVID-19 hautement efficace utilisant une analyse cellulaire sous tension

La maladie 19 (COVID-19), qui de coronavirus est provoquée par le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère est l'une des cinq pandémies mondiales qui a entraîné les régimes de fatalité les plus élevés. COVID-19 est la troisième pandémie zoonotique de coronavirus (CoV) qui s'est produite pendant les 20 dernières années ; ainsi, ceci indique qu'il y a des possibilités suffisantes de futures manifestations nouvelles de CoV.

Étude : Un basé sur fluorescence, gain-de-signe, système sous tension de cellules d'évaluer l'inhibition principale de la protéase SARS-CoV-2. Crédit d'image : unoL/Shutterstock.com

Mouvement propre

Le transmissibility élevé de SARS-CoV-2, les vaccinations insuffisantes, et l'émergence des variantes SARS-CoV-2 variées proposent que ce virus soit hautement pour devenir un endémique et continue pour cette raison à constituer un danger grave aux êtres humains. Les antivirals efficaces qui visent particulièrement les enzymes virales les plus économisées seraient un mécanisme important pour la demande de règlement contre futur CoVs nouveau.

Actuellement, les antivirals les plus efficaces contre COVID-19 sont des modulateurs immunisés qui aident à réduire la tempête de cytokine résultant de COVD-19 sévère. Actuellement le remdesivir est le seul antiviral qui a été reconnu par les Etats-Unis Food and Drug Administration (FDA) contre SARS-CoV-2. Remdesivir est un acide ribonucléique repurposed (ARN) - l'inhibiteur dépendant (RdRp) de polymérase ARN qui est employé pour la demande de règlement de COVID-19.

Deux enzymes virales qui peuvent être visées pour en de futurs antivirals efficaces sont des polymérases de génome viral comme RdRp, ainsi que des protéases de virus-détail qui fendent le polyprotein viral dans les protéines fonctionnelles. L'efficacité du remdesivir s'est avérée pour être limitée ; cependant, le remdesivir combiné avec un inhibiteur de la protéase SARS-CoV-2 a pu être hautement efficace contre COVID-19.

SARS-CoV-2 code pour deux protéases virales, hors lesquelles de la protéase principale comme une chymotrypsine de CoV 3 (Mpro) est le plus indispensable. Mpro est impliqué dans le rétablissement des protéines non-structurelles matures de CoV, y compris les sous-unités de RdRp. Puisque Mpro est essentiel pour la production du replicase de génome viral, il pourrait être employé pour le développement d'un système de dépistage des drogues cellulaire.

Une étude neuve publiée dans la recherche antivirale a visé à indiquer une analyse cellulaire qui impliqué l'isolement et la quantification de SARS-CoV-2 Mpro en cellules humaines faute d'autres protéines. La réponse à dose donnée de l'activité de médicament contre SARS-CoV-2 Mpro a été évaluée, avec la guérison du fonctionnement de Mpro après que le médicament ait été retiré.

Au sujet de l'étude

Les cellules HEK293 impliquées d'étude actuelle pour déterminer l'effet des médicaments sur l'expression intracellulaire, ainsi que le fonctionnement de Mpro. Des plasmides spécifiques de l'acide désoxyribonucléique (ADN) ont été construits pour l'expression de Mpro en ces cellules.

Toutes les protéines ont été extraites de la transfecté et untransfected les cellules qui ont été traitées avec des médicaments ou moquerie-traité suivi d'immunoempreinte. Ceci a été suivi de microscopie à fluorescence pour la quantification et d'analyse de MTT pour la détermination de la viabilité de cellules. En outre, les cellules Calu-3 ont été employées pour des manipulations du virus SARS-CoV-2 et l'isolement sous tension d'ARN.

Découvertes d'étude

Les résultats ont indiqué que quand le vecteur de plasmide a été exprimé en cellules HEK293, il a mené à la production d'un peptide de fusion de GST-Mpro. Cette protéine de fusion s'est avérée auto-pour se fendre dans GST et entièrement - la protéine fonctionnelle de Mpro.

La quantification de la protéine a été réalisée par l'utilisation d'un biocapteur qui impliqué le développement de la protéine fluorescente rouge dimérisation-dépendante (RFP) avec un site de clivage de la caspase 3 qui a été conçu entre les deux domaines dans un élément de protéine de fusion. Le clivage de la caspase 3 aurait comme conséquence la perte de fluorescence.

La co-expression de Mpro avec le biocapteur a eu comme conséquence le clivage du biocapteur et plus plus loin a mené à la perte de fluorescence de demande de propositions. En outre, la mutation d'un résidu de glutamine dans le site de clivage de Mpro avec de l'alanine a eu comme conséquence le clivage diminué du biocapteur et a augmenté la fluorescence par rapport au MRO de grammage. Comparativement, la mutation de la glutamine avec la Co-transfection avec le grammage Mpro a mené à une diminution encore plus grande de clivage de demande de propositions et de fluorescence plus élevée.

Création et expression d'un biocapteur de demande de propositions pour trouver CoV2 Mprofunction : A) La séquence consensus pour le clivage par Mpro, a été calculée utilisant la version de WebLogo 3,0 utilisant 77 sites de clivage, 11 de Radars à ouverture synthétique-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV2, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43 et HCoV-HKU1 (fig. supplémentaire 1). B) Description graphique du vecteur de pRFP-AVLQS, indiquant le site de clivage d'AVLQS qui a été comporté entre les deux domaines de demande de propositions exigés pour être attaché pour tenir compte de l'association et de la fluorescence. L'expression de la protéine de fusion de demande de propositions est conduite par le promoteur de CMV. C) L'immunoempreinte des cellules de HEK-293T untransfected (voie 1) ou transfecté avec l'un ou l'autre le vecteur parental de pRFPA1B1-DEVD (voie 2), ou le vecteur de pRFP-AVLQS (voie 3), pour demande de propositions (Commission inférieure), ou pour grand T-antigène SV40 (LT, kDa ∼94, Commission supérieure) comme contrôle de charge. La première bande lourde est la protéine fluorescente de demande de propositions (demande de propositions, le kDa ∼54) et la bande plus claire inférieure représente un produit de décomposition qui est naturellement fabriqué sur l'expression dans le contraste de phase de cellules humaines (∼40 kDa RFP*) D) (impair) et les images de fluorescence (même) saisies simultanément utilisant la microscopie inversée expliquent les cellules untransfected non fluorescentes (cao et autres, 2007), et les niveaux assimilés de la fluorescence de demande de propositions dans la transfecté de cellules avec pRFPA1B1-DEVD ou pRFP-AVLQS (comparez 4 contre 6). Barre = μm 156.

Le bilan du fonctionnement de SARS-CoV-2 Mpro a eu lieu avec l'aide d'un inhibiteur de Mpro connu sous le nom de GC376. La demande de règlement de Mpro avec des dilutions de dix fois de 100 à 0,01 (µM) GC376 micromolar a eu comme conséquence aucun clivage du biocapteur, alors que la demande de règlement avec 1 µM GC376 a montré la guérison des niveaux de fluorescence. Troisièmement, la demande de règlement avec 10 et 100 le µM GC376 a montré des hauts niveaux de guérison de fluorescence de demande de propositions. On n'a observé aucune toxicité après la demande de règlement des cellules avec toutes les concentrations de GC376.

L'activité d'inhibiteur de Mpro de deux médicaments approuvés par le FDA, Bepridil et Alverine, étaient comparée à GC367. Les résultats ont indiqué que l'ampleur de l'inhibition du fonctionnement intracellulaire de Mpro était plus élevée avec GC367 par rapport aux deux médicaments. En outre, on a observé la guérison du fonctionnement de Mpro par la perte de fluorescence en cellules exprimant Mpro quand l'inhibiteur GC367 a été retiré.

Inhibition GC376 de CoV2 intracellulaire Mpro : A) Les cellules AD293 étaient Co-transfecté avec le pGST-Mpro et pRFP-AVLQS (rapport de 1 : 4) pour 21 cellules de H. souillées avec Hoechst ont été traités avec des niveaux de variation de GC376 : 0 μM (triangles ouvertes), 0,01 μM (grands dos ouverts), 0,1 μM (grands dos remplis), 1 μM (cercles ouverts), μM 10 (triangles remplies), et μM 100 (cercles remplis). La sortie de fluorescence des cellules sous tension a été surveillée comme dans fig. 3F pour Hoechst-ADN et demande de propositions chaque heure pour 17 h après ajout de GC376. L'inhibition de Mpro par GC376 est indiquée en augmentant des niveaux de la fluorescence (notez la sensibilité plus grande de l'écaille dans fig. 4A par rapport à fig. 3F). B) Les images montrées ont lieu de l'heure 36, ou 15 h après ajout de drug/OPTIMEM), concevant pour la demande de propositions (même Commissions) ou la demande de propositions et l'ADN (Commissions impaires), utilisant le Cytation 1 lecteur de représentation comme décrit ci-dessus. Barre = μm 1000.

Conclusion

L'étude actuelle était tout à fait efficace en déterminant l'importance de Mpro pour le développement des antivirals. Bien que certains médicaments approuvés par le FDA ayant une affinité pour Mpro intracellulaire et peuvent pour cette raison repurposed pour la demande de règlement de COVID-19.

Cependant, ces médicaments n'ont pas donné des résultats prometteurs. Par conséquent, le développement des antivirals neufs avec une affinité plus élevée pour Mpro est essentiel, car ces agents pourraient empêcher leur fonctionnement et assurer la protection contre SARS-CoV-2 et futurs coronaviruses zoonotiques.

Journal reference:
Suchandrima Bhowmik

Written by

Suchandrima Bhowmik

Suchandrima has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Microbiology and a Master of Science (M.Sc.) degree in Microbiology from the University of Calcutta, India. The study of health and diseases was always very important to her. In addition to Microbiology, she also gained extensive knowledge in Biochemistry, Immunology, Medical Microbiology, Metabolism, and Biotechnology as part of her master's degree.

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