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Lo studio rivela un sistema di screening altamente efficace COVID-19 che utilizza ad un'analisi basata a cella in tensione

La malattia 19 (COVID-19), che di Coronavirus è causata dal coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo è una delle cinque pandemie mondiali che ha causato gli più alti tassi di mortalità. COVID-19 è la terza pandemia zoonotica di coronavirus (CoV) che si è presentata durante i 20 anni ultimi; quindi, questo indica che ci sono ampie possibilità degli scoppi novelli futuri di CoV.

Studio: Un basato a fluorescenza, guadagno-de-segnale, sistema in tensione delle cellule valutare inibizione principale della proteasi SARS-CoV-2. Credito di immagine: unoL/Shutterstock.com

Sfondo

L'alto transmissibility di SARS-CoV-2, le vaccinazioni insufficienti e l'emergenza di varie varianti SARS-CoV-2 suggeriscono che questo virus sia altamente probabile trasformarsi in in un endemico e quindi continui a posare una grave minaccia agli esseri umani. Gli efficaci antivirals che specificamente mirano agli enzimi virali conservati sarebbero un meccanismo importante per il trattamento contro CoVs novello futuro.

Attualmente, i antivirals più efficaci contro COVID-19 sono immunomodulatori che contribuiscono a diminuire la tempesta di citochina derivando da COVD-19 severo. Attualmente il remdesivir è il solo antivirale che è stato approvato dagli Stati Uniti Food and Drug Administration (FDA) contro SARS-CoV-2. Remdesivir è un acido ribonucleico repurposed (RNA) - inibitore dipendente (RdRp) del RNA polimerasi che è usato per il trattamento di COVID-19.

Due enzimi virali che possono essere mirati a per negli efficaci antivirals futuri sono le polimerasi virali del genoma come RdRp come pure proteasi virus-specifiche che fendono il poliproteico virale nelle proteine funzionali. L'efficacia di remdesivir è stata trovata per essere limitata; tuttavia, il remdesivir combinato con un inibitore di proteasi SARS-CoV-2 ha potuto essere altamente efficace contro COVID-19.

SARS-CoV-2 codifica per due proteasi virali, cui dalla proteasi principale del tipo di chimotripsina di CoV 3 (Mpro) è più vitale quello. Mpro è compreso nella generazione di proteine non strutturali mature di CoV, compreso gli sottounità di RdRp. Poiché Mpro è essenziale per la produzione del replicase virale del genoma, potrebbe essere usato per lo sviluppo ad un di un sistema di screening basato a cella della droga.

Un nuovo studio ha pubblicato nella ricerca antivirale mirante per riferire ad un'analisi basata a cella che ha compreso l'isolamento e la quantificazione di SARS-CoV-2 Mpro in cellule umane in assenza di altre proteine. La reazione al dosaggio di attività della droga contro SARS-CoV-2 Mpro è stata valutata, con il ripristino della funzione di Mpro dopo che la droga è stata eliminata.

Circa lo studio

Lo studio corrente ha compreso le celle HEK293 per la determinazione dell'effetto delle droghe sull'espressione intracellulare come pure la funzione di Mpro. I plasmidi specifici dell'acido desossiribonucleico (DNA) sono stati costruiti per l'espressione di Mpro in queste celle.

Le proteine totali sono state estratte sia dalle celle transfected che untransfected che sono state curate con le droghe o derisione-trattato seguito immunoblotting. Ciò è stata seguita da microscopia di fluorescenza per quantificazione e dall'analisi di MTT per la determinazione dell'attuabilità delle cellule. Ancora, le celle Calu-3 sono state usate per le manipolazioni del virus SARS-CoV-2 e l'isolamento in tensione del RNA.

Risultati di studio

I risultati hanno indicato che quando il vettore del plasmide è stato espresso in celle HEK293, piombo alla produzione di un peptide di fusione di GST-Mpro. Questa proteina di fusione è stata trovata auto-per fendersi in GST e completamente - nella proteina funzionale di Mpro.

La quantificazione della proteina è stata raggiunta con l'uso di un biosensore che ha compreso lo sviluppo di proteina fluorescente rossa dimerizzazione-dipendente (RFP) con un sito di fenditura di caspase 3 che è stato costruito fra i due domini in una costruzione della proteina di fusione. La fenditura del caspase 3 provocherebbe la perdita di fluorescenza.

L'co-espressione di Mpro con il biosensore ha provocato la fenditura del biosensore e più ulteriormente piombo alla perdita di fluorescenza di RFP. Ancora, la mutazione di un residuo della glutamina nel sito di fenditura di Mpro con l'alanina ha provocato la fenditura in diminuzione del biosensore ed ha aumentato la fluorescenza rispetto al MRO del peso. Comparativamente, la mutazione della glutamina con la co-transfezione con peso Mpro piombo ad una diminuzione ancora maggior nella fenditura di RFP e nell'più alta fluorescenza.

Creazione ed espressione di un biosensore di RFP per individuare CoV2 Mprofunction: A) La sequenza di consenso per fenditura da Mpro, è stata computata facendo uso delle versioni di WebLogo 3,0 facendo uso di 77 siti di fenditura, 11 ciascuno da SAR-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV2, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43 e HCoV-HKU1 (fig. supplementare 1). B) Dipinto grafico del vettore del pRFP-AVLQS, indicante il sito di fenditura di AVLQS che è stato incorporato fra i due domini di RFP richiesti di essere legato per tenere conto l'associazione e la fluorescenza. L'espressione della proteina di fusione di RFP è determinata dal promotore CMV. C) Immunoblotting delle celle di HEK-293T untransfected (corsia 1) o transfected con il vettore parentale di pRFPA1B1-DEVD (corsia 2), o il vettore del pRFP-AVLQS (corsia 3), per il RFP (pannello inferiore), o per SV40 il grande T-antigene (LT, kDa ∼94, comitato superiore) come controllo di caricamento. La banda superiore pesante è la proteina fluorescente di RFP (RFP, kDa ∼54) e la banda della scarsa visibilità rappresenta un prodotto della scomposizione che naturalmente è prodotta sopra l'espressione nel contrasto di fase delle cellule umane (∼40 il kDa RFP*) D) (dispari) e le immagini della fluorescenza (anche) catturate simultaneamente facendo uso di microscopia invertita dimostra le celle untransfected non fluorescenti (cao et al., 2007) e simili livelli di fluorescenza di RFP in celle transfected con pRFPA1B1-DEVD o pRFP-AVLQS (confronti 4 contro 6). Barra = μm 156.

La valutazione della funzione di SARS-CoV-2 Mpro ha avuto luogo con l'aiuto di un inibitore di Mpro conosciuto come GC376. Il trattamento di Mpro con le diluizioni composte di dieci parti di 100 - 0,01 (µM) GC376 micromolar ha provocato nessuna fenditura del biosensore, mentre il trattamento con 1 µM GC376 ha mostrato il ripristino dei livelli della fluorescenza. In terzo luogo, il trattamento con 10 e 100 µM GC376 ha mostrato gli alti livelli del ripristino della fluorescenza di RFP. Nessuna tossicità è stata osservata dopo il trattamento delle celle con tutte le concentrazioni di GC376.

L'attività dell'inibitore di Mpro di due droghe approvate dalla FDA, bepridile e Alverine, è stata confrontata a GC367. I risultati hanno indicato che le dimensioni di inibizione di funzione intracellulare di Mpro erano più alte con GC367 rispetto alle due droghe. Ancora, il ripristino della funzione di Mpro è stato osservato con la perdita di fluorescenza in celle che esprimono Mpro quando l'inibitore GC367 è stato eliminato.

Inibizione GC376 di CoV2 intracellulare Mpro: A) Le celle AD293 erano co--transfected con il pGST-Mpro e il pRFP-AVLQS (un rapporto di 1: 4) per 21 cella del H. macchiata con Hoechst è stato trattato con i livelli di variazione di GC376: 0 μM (triangoli aperti), 0,01 μM (quadrati aperti), 0,1 μM (quadrati riempiti), 1 μM (cerchi aperti), 10 μM (triangoli riempiti) e 100 μM (cerchi riempiti). L'output della fluorescenza delle celle in tensione è stato riflesso come nella fig. 3F per Hoechst-DNA ed il RFP ogni ora per 17 h dopo l'aggiunta di GC376. L'inibizione di Mpro da GC376 è indicata aumentando i livelli di fluorescenza (noti la maggior sensibilità del disgaggio nella fig. 4A rispetto alla fig. 3F). B) Le immagini indicate provengono a partire dall'ora 36, o 15 h dopo l'aggiunta di drug/OPTIMEM), visualizzando per il RFP (anche comitati) o RFP e DNA (comitati dispari), facendo uso del Cytation 1 lettore della rappresentazione come precedentemente descritto. Barra = μm 1000.

Conclusione

Lo studio corrente era abbastanza efficace nella determinazione dell'importanza di Mpro per lo sviluppo dei antivirals. Sebbene determinate droghe approvate dalla FDA che hanno un'affinità per Mpro intracellulare e possano quindi essere repurposed per il trattamento di COVID-19.

Tuttavia, queste droghe non sono riuscito a mostrare i risultati di promessa. Di conseguenza, lo sviluppo di nuovi antivirals con un'più alta affinità per Mpro è cruciale, poichè questi agenti potrebbero inibire la loro funzione ed assicurare la protezione contro SARS-CoV-2 e coronaviruses zoonotici futuri.

Journal reference:
Suchandrima Bhowmik

Written by

Suchandrima Bhowmik

Suchandrima has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Microbiology and a Master of Science (M.Sc.) degree in Microbiology from the University of Calcutta, India. The study of health and diseases was always very important to her. In addition to Microbiology, she also gained extensive knowledge in Biochemistry, Immunology, Medical Microbiology, Metabolism, and Biotechnology as part of her master's degree.

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