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O estudo revela um sistema de selecção COVID-19 altamente eficaz que utiliza um ensaio baseado em celulas vivo

A doença 19 de Coronavirus (COVID-19), que é causada pelo coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) é uma das cinco pandemias mundiais que causou as taxas de fatalidade as mais altas. COVID-19 é a terceira pandemia zoonotic do coronavirus (CoV) que ocorreu nos últimos 20 anos; assim, isto indica que há umas possibilidades amplas das manifestações novas futuras de CoV.

Estudo: Fluorescência-baseado, ganho--sinal, sistema vivo da pilha avaliar a inibição principal do protease SARS-CoV-2. Crédito de imagem: unoL/Shutterstock.com

Fundo

O transmissibility alto de SARS-CoV-2, as insuficientes vacinações, e a emergência das várias variações SARS-CoV-2 sugerem que este vírus seja altamente provável se transformar um endémico e continue conseqüentemente a levantar uma ameaça grave aos seres humanos. Os antivirais eficazes que visam especificamente as enzimas virais as mais conservadas seriam um mecanismo importante para o tratamento contra CoVs novo futuro.

Presentemente, os antivirais os mais eficazes contra COVID-19 são os moduladores imunes que ajudam a reduzir a tempestade do cytokine resultando de COVD-19 severo. Presentemente o remdesivir é o único antiviral que foi aprovado pelos Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA) contra SARS-CoV-2. Remdesivir é um ácido ribonucléico repurposed (RNA) - o inibidor dependente da polimerase (RdRp) de RNA que é usado para o tratamento de COVID-19.

Duas enzimas virais que podem ser visadas para nos antivirais eficazes futuros são polimerases virais do genoma como RdRp, assim como os proteases vírus-específicos que fendem o polyprotein viral em proteínas funcionais. A eficácia do remdesivir foi encontrada para ser limitada; contudo, o remdesivir combinado com um inibidor de protease SARS-CoV-2 podia ser altamente eficaz contra COVID-19.

SARS-CoV-2 codifica para dois proteases virais, fora que de CoV 3 quimotripsina-como o Protease principal (Mpro) é mais vital. Mpro é envolvido na geração de proteínas não-estruturais maduras de CoV, incluindo as subunidades de RdRp. Desde que Mpro é essencial para a produção do replicase viral do genoma, poderia ser usado para a revelação de um sistema de selecção baseado em celulas da droga.

Um estudo novo publicou na pesquisa antivirosa apontada relatar um ensaio baseado em celulas que envolvesse o isolamento e a quantificação de SARS-CoV-2 Mpro em pilhas humanas na ausência de outras proteínas. A dose- da actividade da droga contra SARS-CoV-2 Mpro foi avaliada, junto com a recuperação da função de Mpro depois que a droga foi removida.

Sobre o estudo

O estudo actual envolveu as pilhas HEK293 para determinar o efeito das drogas na expressão intracelular, assim como a função de Mpro. Os plasmídeo específicos do ácido deoxyribonucleic (ADN) foram construídos para a expressão de Mpro nestas pilhas.

As proteínas totais foram extraídas das pilhas transfected e untransfected que foram tratadas com as drogas ou zombaria-tratado seguido immunoblotting. Isto foi seguido pela microscopia de fluorescência para a quantificação e pelo ensaio de MTT para a determinação da viabilidade da pilha. Além disso, as pilhas Calu-3 foram usadas para manipulações do vírus SARS-CoV-2 e o isolamento vivos do RNA.

Resultados do estudo

Os resultados indicaram que quando o vector do plasmídeo foi expressado nas pilhas HEK293, conduziu à produção de um peptide da fusão de GST-Mpro. Esta proteína da fusão foi encontrada auto-para fender-se inteiramente em GST e - na proteína funcional de Mpro.

A quantificação da proteína foi conseguida com o uso de um biosensor que envolvesse a revelação da proteína fluorescente vermelha dimerization-dependente (RFP) com um local da segmentação do caspase 3 que fosse projectado entre os dois domínios em uma construção da proteína da fusão. A segmentação do caspase 3 conduziria à perda de fluorescência.

A co-expressão de Mpro com o biosensor conduziu à segmentação do biosensor e conduziu mais à perda de fluorescência do RFP. Além disso, a mutação de um resíduo da glutamina no local da segmentação de Mpro com alanina conduziu à segmentação diminuída do biosensor e aumentou a fluorescência em relação ao MRO do peso. Comparativamente, a mutação da glutamina junto com o co-transfection com peso Mpro conduziu a uma diminuição mesmo maior na segmentação do RFP e em uma fluorescência mais alta.

Criação e expressão de um biosensor do RFP para detectar CoV2 Mprofunction: A) A seqüência de consenso para a segmentação por Mpro, foi computada usando a versão 3,0 usando 77 locais da segmentação, 11 cada dos SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV2, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43 e HCoV-HKU1 de WebLogo (Fig. suplementar 1). B) Descrição gráfica do vector do pRFP-AVLQS, indicando o local da segmentação de AVLQS que foi incorporado entre os dois domínios do RFP exigidos ser tethered para permitir a associação e a fluorescência. A expressão da proteína da fusão do RFP é conduzida pelo promotor CMV. C) Immunoblotting de pilhas de HEK-293T untransfected (pista 1) ou transfected com o vector parental de pRFPA1B1-DEVD (pista 2), ou o vector do pRFP-AVLQS (pista 3), para RFP (mais baixo painel), ou para o grande T-antígeno SV40 (LT, kDa ∼94, painel superior) como um controle de carga. A faixa superior pesada é a proteína fluorescente do RFP (RFP, o kDa ∼54) e a faixa mais clara mais baixa representa um produto de decomposição que seja produzido naturalmente em cima da expressão no contraste da fase das pilhas humanas (∼40 kDa RFP*) D) (impar) e as imagens da fluorescência (mesmo) capturadas simultaneamente usando a microscopia invertida demonstram as pilhas untransfected não-fluorescentes (Cao e outros, 2007), e os níveis similares de fluorescência do RFP nas pilhas transfected com o pRFPA1B1-DEVD ou o pRFP-AVLQS (compare 4 contra 6). Barra = μm 156.

A avaliação da função de SARS-CoV-2 Mpro ocorreu com a ajuda de um inibidor de Mpro conhecido como GC376. O tratamento de Mpro com diluições da dez-dobra de 100 a 0,01 (µM) GC376 micromolar conduziu a nenhuma segmentação do biosensor, visto que o tratamento com 1 µM GC376 mostrou a recuperação de níveis da fluorescência. Em terceiro lugar, o tratamento com 10 e 100 µM GC376 mostrou níveis elevados de recuperação da fluorescência do RFP. Nenhuma toxicidade foi observada depois do tratamento das pilhas com todas as concentrações de GC376.

A actividade do inibidor de Mpro de duas drogas aprovados pelo FDA, Bepridil e Alverine, foi comparada a GC367. Os resultados indicaram que a extensão da inibição de função intracelular de Mpro era mais alta com o GC367 em relação às duas drogas. Além disso, a recuperação da função de Mpro foi observada com a perda de fluorescência nas pilhas que expressam Mpro quando o inibidor GC367 foi removido.

Inibição GC376 de CoV2 intra-celular Mpro: A) As pilhas AD293 eram co-transfected com pGST-Mpro e o pRFP-AVLQS (relação do 1:4) para 21 pilhas do H. manchadas com Hoechst foi tratado com os níveis de variação de GC376: 0 μM (triângulos abertos), 0,01 μM (quadrados abertos), 0,1 μM (quadrados enchidos), 1 μM (círculos abertos), μM 10 (triângulos enchidos), e μM 100 (círculos enchidos). A saída da fluorescência das pilhas vivas foi monitorada como no figo. 3F para Hoechst-ADN e RFP cada hora para 17 h depois da adição de GC376. A inibição de Mpro por GC376 é indicada aumentando níveis de fluorescência (note a sensibilidade maior da escala no figo. 4A em relação ao figo. 3F). B) As imagens mostradas são da hora 36, ou os 15 h após a adição de drug/OPTIMEM), visualizando para RFP (mesmo painéis) ou RFP e ADN (painéis impares), usando o Cytation 1 leitor da imagem lactente como descrito acima. Barra = μm 1000.

Conclusão

O estudo actual era bastante eficaz em determinar a importância de Mpro para a revelação dos antivirais. Embora determinadas drogas aprovados pelo FDA que têm uma afinidade para Mpro intracelular e podem conseqüentemente ser repurposed para o tratamento de COVID-19.

Contudo, estas drogas não mostraram resultados prometedores. Conseqüentemente, a revelação de antivirais novos com uma afinidade mais alta para Mpro é crucial, porque estes agentes poderiam inibir sua função e fornecer a protecção contra SARS-CoV-2 e os coronaviruses zoonotic futuros.

Journal reference:
Suchandrima Bhowmik

Written by

Suchandrima Bhowmik

Suchandrima has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Microbiology and a Master of Science (M.Sc.) degree in Microbiology from the University of Calcutta, India. The study of health and diseases was always very important to her. In addition to Microbiology, she also gained extensive knowledge in Biochemistry, Immunology, Medical Microbiology, Metabolism, and Biotechnology as part of her master's degree.

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