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El estudio revela un sistema de detección altamente efectivo COVID-19 que utiliza un análisis célula-basado vivo

La enfermedad 19 (COVID-19), que de Coronavirus es causada por el coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática es uno de los cinco pandémicos mundiales que ha causado los regímenes de fatalidad más altos. COVID-19 es el tercer pandémico zoonótico del coronavirus (CoV) que ha ocurrido en los 20 años pasados; así, esto indica que hay posibilidades suficientes de los brotes nuevos futuros de CoV.

Estudio: Fluorescencia-haber basado, avance-de-señal, sistema vivo de la célula de evaluar la inhibición principal de la proteasa SARS-CoV-2. Haber de imagen: unoL/Shutterstock.com

Fondo

La alta transmisibilidad de SARS-CoV-2, las vacunaciones escasas, y la aparición de las diversas variantes SARS-CoV-2 sugieren que este virus sea altamente probable convertirse en un endemic y por lo tanto continúe plantear una amenaza grave a los seres humanos. Los antivirals efectivos que apuntan específicamente las enzimas virales conservadas serían un mecanismo importante para el tratamiento contra CoVs nuevo futuro.

Actualmente, los antivirals más efectivos contra COVID-19 son los moduladores inmunes que ayudan a reducir la tormenta del cytokine resultando de COVD-19 severo. El remdesivir es actualmente el único antivirus que ha sido aprobado por los Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA) contra SARS-CoV-2. Remdesivir es un ácido ribonucleico repurposed (ARN) - el inhibidor relacionado de la polimerasa (RdRp) de ARN que se utiliza para el tratamiento de COVID-19.

Dos enzimas virales que se pueden apuntar para en los antivirals efectivos futuros son polimerasas virales del genoma como RdRp, así como las proteasas virus-específicas que hienden el polyprotein viral en las proteínas funcionales. La eficacia del remdesivir se ha encontrado para ser limitada; sin embargo, el remdesivir combinado con un inhibidor de proteasa SARS-CoV-2 podía ser altamente efectivo contra COVID-19.

SARS-CoV-2 codifica para dos proteasas virales, fuera cuyo de CoV 3 quimotripsina-como la proteasa principal (Mpro) está el más vital. Mpro está implicado en la generación de proteínas no-estructurales maduras de CoV, incluyendo las subunidades de RdRp. Puesto que Mpro es esencial para la producción del replicase viral del genoma, podría ser utilizado para el revelado de un sistema de detección célula-basado de la droga.

Un nuevo estudio publicó en la investigación antivirus estado dirigida para denunciar un análisis célula-basado que implicó el aislamiento y la cuantificación de SARS-CoV-2 Mpro en células humanas en ausencia de otras proteínas. La respuesta a la dosis de la actividad de la droga contra SARS-CoV-2 Mpro fue evaluada, junto con la recuperación de la función de Mpro después de que la droga fuera quitada.

Sobre el estudio

El estudio actual implicó las células HEK293 para determinar el efecto de drogas sobre la expresión intracelular, así como la función de Mpro. Los plásmidos específicos del ácido desoxirribonucléico (DNA) fueron construidos para la expresión de Mpro en estas células.

Las proteínas totales fueron extraídas de las células transfected y untransfected que fueron tratadas con las drogas o mofa-tratado seguido immunoblotting. Esto fue seguida por la microscopia de fluorescencia para la cuantificación y el análisis de MTT para la determinación de la viabilidad de la célula. Además, las células Calu-3 fueron utilizadas para las manipulaciones del virus SARS-CoV-2 y el aislamiento vivos del ARN.

Conclusión del estudio

Los resultados indicaron que cuando el vector del plásmido fue expresado en las células HEK293, llevó a la producción de un péptido de la fusión de GST-Mpro. Esta proteína de la fusión fue encontrada uno mismo-para henderse en GST y completo - la proteína funcional de Mpro.

La cuantificación de la proteína fue lograda con el uso de un biosensor que implicó el revelado de la proteína fluorescente roja dimerización-relacionada (RFP) con un sitio de la hendidura del caspase 3 que fue dirigido entre los dos dominios en una construcción de la proteína de la fusión. La hendidura del caspase 3 daría lugar a la baja de la fluorescencia.

La co-expresión de Mpro con el biosensor dio lugar a la hendidura del biosensor y llevó más lejos a la baja de la fluorescencia del RFP. Además, la mutación de un residuo de la glutamina en el sitio de la hendidura de Mpro con la alanina dio lugar a la hendidura disminuida del biosensor y aumentó fluorescencia con respecto al MRO del peso. Comparativamente, la mutación de la glutamina junto con la co-transfección con el peso Mpro llevó a una disminución incluso mayor de la hendidura del RFP y de una fluorescencia más alta.

Creación y expresión de un biosensor del RFP para descubrir CoV2 Mprofunction: A) La serie de consenso para la hendidura por Mpro, era calculada usando la versión de WebLogo 3,0 usando 77 sitios de la hendidura, 11 por cada uno de los SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV2, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43 y HCoV-HKU1 (fig. suplemental 1). B) Pintura gráfica del vector del pRFP-AVLQS, indicando el sitio de la hendidura de AVLQS que fue incorporado entre los dos dominios del RFP requeridos ser atado para tener en cuenta la asociación y la fluorescencia. La expresión de la proteína de la fusión del RFP es impulsada por el promotor CMV. C) Immunoblotting de las células de HEK-293T untransfected (la senda 1) o transfected con el vector parental de pRFPA1B1-DEVD (senda 2), o el vector del pRFP-AVLQS (senda 3), para RFP (un panel más inferior), o para el T-antígeno grande SV40 (LT, kDa ∼94, panel superior) como mando de cargamento. La banda superior pesada es la proteína fluorescente del RFP (RFP, el kDa ∼54) y la banda de la luz corta cuanto representa un producto de descomposición que se produce naturalmente sobre la expresión en el contraste de la fase de las células humanas (∼40 kDa RFP*) D) (impar) y las imágenes de la fluorescencia (incluso) capturadas simultáneamente usando microscopia invertida demuestra las células untransfected no fluorescentes (Cao y otros, 2007), y los niveles similares de fluorescencia del RFP en las células transfected con pRFPA1B1-DEVD o el pRFP-AVLQS (compare 4 comparado con 6). Barra = μm 156.

La evaluación de la función de SARS-CoV-2 Mpro ocurrió con la ayuda de un inhibidor de Mpro conocido como GC376. El tratamiento de Mpro con diluciones décuplas de 100 a 0,01 (µM) GC376 micromolar dio lugar a ninguna hendidura del biosensor, mientras que el tratamiento con 1 µM GC376 mostró la recuperación de los niveles de la fluorescencia. En tercer lugar, el tratamiento con 10 y 100 el µM GC376 mostró niveles de la recuperación de la fluorescencia del RFP. No se observó ninguna toxicidad después del tratamiento de células con todas las concentraciones de GC376.

La actividad del inhibidor de Mpro de dos drogas aprobadas por la FDA, Bepridil y Alverine, fue comparada a GC367. Los resultados indicaron que el fragmento de la inhibición de la función intracelular de Mpro era más alto con GC367 con respecto a las dos drogas. Además, la recuperación de la función de Mpro fue observada con la baja de la fluorescencia en las células que expresaban Mpro cuando el inhibidor GC367 fue quitado.

Inhibición GC376 de CoV2 intracelular Mpro: A) Las células AD293 eran co-transfected con el pGST-Mpro y el pRFP-AVLQS (índice de 1: 4) para 21 células del H. manchadas con Hoechst fue tratado con los niveles de variación de GC376: 0 μM (triángulos abiertos), 0,01 μM (cuadrados abiertos), 0,1 μM (cuadrados llenados), 1 μM (círculos abiertos), μM 10 (triángulos llenados), y μM 100 (círculos llenados). El rendimiento de la fluorescencia de las células vivas fue vigilado como en fig. 3F para Hoechst-DNA y el RFP cada hora para 17 h después de la adición de GC376. La inhibición de Mpro por GC376 es indicada aumentando niveles de fluorescencia (observe la mayor sensibilidad de la escala en fig. 4A con respecto a fig. 3F). B) Las imágenes mostradas son a partir de la hora 36, o 15 h después de la adición de drug/OPTIMEM), visualizando para RFP (incluso paneles) o RFP y DNA (paneles impares), usando el Cytation 1 programa de lectura de la proyección de imagen como se describe anteriormente. Barra = μm 1000.

Conclusión

El estudio actual era muy efectivo en la determinación de la importancia de Mpro para el revelado de antivirals. Aunque ciertas drogas aprobadas por la FDA que tienen una afinidad para Mpro intracelular y se puedan por lo tanto repurposed para el tratamiento de COVID-19.

Sin embargo, estas drogas no pudieron mostrar resultados prometedores. Por lo tanto, el revelado de nuevos antivirals con una afinidad más alta para Mpro es crucial, pues estos agentes podrían inhibir su función y ofrecer la protección contra SARS-CoV-2 y los coronaviruses zoonóticos futuros.

Journal reference:
Suchandrima Bhowmik

Written by

Suchandrima Bhowmik

Suchandrima has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Microbiology and a Master of Science (M.Sc.) degree in Microbiology from the University of Calcutta, India. The study of health and diseases was always very important to her. In addition to Microbiology, she also gained extensive knowledge in Biochemistry, Immunology, Medical Microbiology, Metabolism, and Biotechnology as part of her master's degree.

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