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Traçando o C. difficile: Os pesquisadores ribotyping avançados das ajudas da tecnologia mantêm-se a par da doença mortal

Entrevista com caminhada de Seth, investigador principal e professor adjunto, departamento da microbiologia e biologia celular, universidade estadual de Montana

Traçando o C. difficile: Os pesquisadores ribotyping avançados das ajudas da tecnologia mantêm-se a par da doença mortal

Crédito de imagem: Promega Corporaçõ

Pode você dar-nos uma breve introdução a seus interesses do fundo e da pesquisa?

Eu juntei-me à universidade estadual de Montana em 2012, e eu sou agora professor adjunto e cabeça do laboratório da caminhada na universidade. Nós estamos interessados no microbiome humano do intestino, que é actualmente bastante um campo popular.

Nós estudamos algumas perguntas da investigação básica no campo da ecologia microbiana, tal como que os organismos vivem no intestino e de como interagem com seu anfitrião (nós), assim como perguntas relativas às doenças infecciosas e aos micróbios patogénicos antimicrobial-resistentes que causam a doença no intestino.

Nós colaboramos com outros grupos, por exemplo, com sócios que investigam a doença de entranhas inflamatório e a estão tentando estabelecer a interacção do anfitrião-micróbio patogénico.

Nós igualmente temos uma escala dos projectos que exploram como os micróbios patogénicos circulam nos hospitais, com o objectivo das ferramentas se tornando para seguir as manifestações e os clone recentemente emergentes do monitor que poderiam ser resistentes ao tratamento.

Um dos micróbios patogénicos principais que nós estamos interessados dentro é Clostridioides difficile. Esta bactéria Relvado-positiva é a causa a mais comum da infecção (nosocomial) hospital-adquirida nos E.U. e pode causar a doença gastrintestinal severa com morbosidade e taxas de mortalidade altas.

A epidemiologia das bactérias está mudando sempre, assim que nós precisamos realmente as ferramentas de diferenciar-se entre tensões difficile diferentes do C.

Traçando o C. difficile: Os pesquisadores ribotyping avançados das ajudas da tecnologia mantêm-se a par da doença mortal

Crédito de imagem: Promega Corporaçõ

Pode você explicar o que estas ferramentas do `' são e como poderiam ser usadas?

Nós desenvolvemos as ferramentas baratas para caracterizar isolados e estamos construindo bases de dados para facilitar o trabalho de outro na comunidade científica. Nós igualmente usamos os modelos do rato do C. difficile para compreender como este micróbio patogénico é espalhado e que factores são importantes para impedir a doença.

A nível do hospital, há um tipo real do ` da necessidade' os isolados, para medir sua diversidade genética e fenotípica. Nós desenvolvemos uma ferramenta usando uma técnica molecular conhecida como ribotyping, que identificasse e caracterizasse tensões diferentes de difficile do C. baseado na informação genética em torno do RNA ribosomal (rRNA) - genes da codificação.

Esta informação diz-nos sobre seus relacionamentos filogenéticas; como estreitamente relacionado são e se as variações novas estão estalando acima.

As ferramentas de Ribotyping podem ser usadas em diagnósticos e no controle clínicos da infecção, para estabelecer como as tensões patogénicos diferentes estão movendo ao redor um hospital e se as manifestações estão causadas por tensões periódicas ou novas.

A fiscalização da resistência é igualmente uma prioridade máxima para as comunidades clínicas e de pesquisa, para ajudar com a revelação de antibióticos novos. No caso do controle da infecção, a dactilografia da tensão deve ser rápida, que é onde nossa da reacção em cadeia fluorescente da polimerase da alto-produção (PCR) ferramenta ribotyping entra.

Como o PCR fluorescente que ribotyping trabalha e por que você usa este método sobre outras técnicas?

O PCR que ribotyping é um ensaio genotyping barato, gel-baseado para a identificação de linhagens difficile específicas do C. Determina as diferenças de comprimento entre genes da codificação do rRNA 16S e do rRNA 23S em aproximadamente 11 operons da rRNA-codificação em torno do genoma difficile do C.

Usando amplicons do PCR de uma primeira demão fluorescente etiquetada e da execução sob medida com o Sanger-estilo (capilar-baseado) que arranja em seqüência, o PCR fluorescente que ribotyping melhora na técnica ribotyping original e nosso laboratório desenvolveu uma aproximação similar e aplicou-a ao C. difficile.

os métodos Seqüência-baseados, tais como a dactilografia da seqüência do multi-locus (MLST) e o genoma que arranjam em seqüência, são caros comparados com os métodos do gel e agora capilar-baseado. Os métodos gel-baseados comuns incluem a análise do endonuclease da electroforese (PFGE) e da limitação do gel do pulsar-campo (REA) que datilografa, mas seus dados resultantes não são portáteis entre laboratórios.

A mobilidade dos dados é particularmente importante para estudos da epidemiologia de modo que as relações possam ser feitas entre casos da doença através do globo e os testes padrões da emergência possam ser identificados rapidamente. Nós realizamos um estudo multicentrado que demonstrasse a mobilidade e a rentabilidade de nosso protocolo ribotyping fluorescente estandardizado do PCR.1

Quatro laboratórios diferentes e três centros arranjando em seqüência diferentes conseguiram identificações difficile altamente exactas e precisas do ribotype do C. usando nossos protocolo e base de dados centralizada. O que é realmente importante para a mobilidade é que os laboratórios falam uma língua comum do `'. Se nós usamos as mesmas convenções de nomeação e as mesmas plataformas e bases de dados, a informação pode viajar muito mais amplamente.

Que papel sua base de dados joga em ribotyping difficile do C.?

Nós temos construído nossa base de dados de ribotypes difficile do C. por em torno de uma década, e actualmente contem 123 ribotypes e é livremente acessível em linha. Nós temos executado amostras clínicas de todo o mundo com o PCR fluorescente que ribotyping em um sequencer capilar (CE) da electroforese e nós podemos rapidamente combinar tensões identificadas com as referências na base de dados.

Nós queremos outros laboratórios poder comparar suas identificações do ribotype com nossa base de dados de referência e estabelecer se o teste padrão combina um C. previamente nomeado ribotype difficile, ou uma tensão recentemente identificada que possa então facilmente ser adicionada à base de dados para os estudos futuros.

Nós desenvolvemos recentemente um pacote de software em R para analisar ràpida os dados do CE, onde os usuários podem entrar e analisar gramaticalmente limas dos dados brutos e obter uma similaridade métrica entre perguntas do desconhecido e a base de dados de referência em um trabalho simples.

Nos primeiros dias, nós éramos dependentes em outras empresas que mantêm suas bases de dados proprietárias e software atualizado, visto que agora, nós podemos analisar e pesquisar defeitos cada lima dos dados brutos recebida. O encanamento pode mesmo ser ajustado a outras bases de dados CE-baseadas - não é limitado ao C. difficile.

Como a escolha do sequencer impacta seu encanamento ribotyping fluorescente do PCR?

Sanger que arranja em seqüência pelo CE é uma tecnologia provada, e agora os instrumentos existem com uma pegada pequena bastante para caber em quase todo o laboratório - você não tem que ser afiliado com uma grande instituição center ou médica arranjar em seqüência para executar estas experiências. Eliminar a trabalheira e o custo de amostras do transporte e esperar resultados são um outro benefício de trazer a em-casa arranjando em seqüência.

Outros sequenceres maiores estão sendo interrompidos devido às despesas gerais significativas do instrumento. As equações da recuperação de custo não estão dando certo para os grandes centros de núcleo que se estão movendo para arranjar em seqüência inteiro do genoma. Os instrumentos menores podiam tornar-se mais apropriados nestes ajustes.

Nós temos começado usar o sistema do CE do estojo compacto do espectro de Promega e temos aperfeiçoado recentemente nosso protocolo neste instrumento, que permitiu que nós mantenham custos para baixo e façam nosso trabalho disponível ao campo muito mais rápido do que antes.

Ter o estojo compacto do espectro disponível está ajudando-nos a conseguir nosso objetivo de fazer ao C. a base de dados difficile um serviço público e a manter para baixo custos para o campo. Finalmente, nós queremos nossa base de dados ser compatível com outras bases de dados globais.

Que você pensa as posses futuras para a epidemiologia ribotyping e clínica?

O que isto faz é posto uma outra ferramenta no conjunto de ferramentas. Eu acredito que o PCR fluorescente que ribotyping poderia ser realmente útil para os clínicos que estão interessados em saber as tensões específicas do C. difficile e outros micróbios patogénicos estão espalhando durante todo o hospital. Eu penso que este poderia ser um jogo-cambiador real para práticas do controle da infecção porque o método é tão rápido.

A outra área onde esta tecnologia poderia ser do valor significativo está permitindo clínicos de estabelecer mesmo se um caso é periódico. Uma vez que um paciente começa retornar com doença difficile do C., terminam frequentemente épocas múltiplas acima de retorno, e então transforma-se uma encenação clínica muito diferente.

Se estão pegarando tensões novas, seu microbiome é ainda suscetível à infecção difficile do C., comparada com se há uma tensão que volte das infecções precedentes. Qualquer um estão tornando-se contaminada outra vez de seu próprio ambiente, que exigiria a descontaminação completa, ou o micróbio patogénico não foi matado durante a primeira ronda do tratamento, assim que uma estratégia terapêutica alternativa pôde ser necessário.

Em termos do que o futuro guardara, eu penso uma vez que os povos vêem como este método trabalha com o C. difficile, eles adaptá-lo-ão muito provavelmente às necessidades específicas de sua hospital ou facilidade. Todo o método que PCR-for baseado será muito adaptável a outras infecções. Ajuda-nos a manter nosso dedo no pulso da epidemiologia da doença infecciosa e a manter-se esperançosamente sobre as manifestações futuras.

Para obter mais informações sobre do laboratório da caminhada e para transferir o software, visite por favor https://thewalklab.com/.

Para obter mais informações sobre do estojo compacto do espectro de Promega, visite por favor www.promega.com/SpectrumCompact

Referências

  1. Martinson JNV, Broadaway S, Lohman E, e outros avaliação da mobilidade e custo de um protocolo fluorescente do PCR Ribotyping para a epidemiologia difficile do clostridium. Microbiol de J Clin, 2015; 53(4): 1192-1197.

Sobre Promega CorporaçõPromega Corporaçõ

Com uma carteira de mais de 3.000 produtos que cobrem os campos da genómica, a análise da proteína e a expressão, a análise celular, a descoberta da droga e a identidade genética, Promega são um líder global em fornecer soluções e o suporte laboral inovativos aos cientistas de vida em ajustes académicos, industriais e do governo.

Os produtos de Promega são usados pelos cientistas de vida que estão fazendo perguntas fundamentais sobre processos biológicos assim como pelos cientistas que estão aplicando o conhecimento científico para diagnosticar e tratar doenças, descobrir a terapêutica nova, e a genética do uso e o teste do ADN para a identificação humana.


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